Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Summary

Denne protokollen beskriver grunnleggende prosedyretrinn for å utføre hel-celle patch-clamp opptak. Denne teknikken tillater studiet av det elektriske oppførsel av neuroner, og når den utføres i hjerneskiver, tillater vurdering av forskjellige nevronale funksjoner fra nevroner som fremdeles er integrert i forholdsvis godt bevart hjernen kretser.

Abstract

Hel-celle patch-clamp-opptak er en elektrofysiologisk teknikk som tillater studiet av de elektriske egenskapene til en vesentlig del av nervecellen. I denne konfigurasjonen er den mikropipette i tett kontakt med cellemembranen, noe som forhindrer strømlekkasje, og dermed gir mer nøyaktige ioniske strømmålinger enn den tidligere brukte intracellulære skarp elektrode opptaksmetode. Klassisk, kan hel-celle-opptak bli utført på neuroner i forskjellige typer av preparater, inkludert cellekultur modeller, dissosierte nevroner, nevroner i hjerneskiver, og i intakte bedøvede eller våkne dyr. Oppsummert har denne teknikken umåtelig bidratt til forståelsen av passive og aktive biofysiske egenskapene hissige celler. En stor fordel med denne teknikken er at den gir informasjon om hvordan spesifikke manipulasjoner (f.eks farmakologiske, experimenter-indusert plastisitet) kan endre spesifikke nevronale funksjoner eller channels i sanntid. I tillegg er betydelige åpning av plasmamembranen tillater den indre pipetten løsningen for å diffundere fritt inn i cytoplasma, noe som gir middel for å innføre medikamenter, for eksempel, agonister eller antagonister av spesifikke intracellulære proteiner, og manipulering av disse målene uten å endre deres funksjon i nabocellene. Denne artikkelen vil fokusere på hel-celle opptak utført på nevroner i hjernen skiver, en forberedelse som har fordelen av å spille inn nevroner i relativt godt bevart hjernen kretser, dvs. i en fysiologisk relevant sammenheng. Spesielt når det kombineres med riktig farmakologi, er denne teknikken et kraftig verktøy som tillater identifisering av spesifikke neuroadaptations som skjedde etter alle typer opplevelser, for eksempel læring, eksponering for narkotika av misbruk, og stress. I sammendraget, hel-celle patch-clamp opptak i hjernen skiver sørge for midler til tiltak i ex vivo forberedelse varige endringeri nervefunksjoner som har utviklet seg i intakte våken dyr.

Introduction

Den patch-clamp teknikk, en elektrofysiologisk teknikk som har blitt utviklet i slutten av 1970-tallet ^1,2, er et primært verktøy for å studere enkelte eller flere ionekanal funksjoner i levende vev. Blant de forskjellige koblings konfigurasjoner som kan oppnås, hel-celle patch-clamp opptak tillater studiet av den elektriske oppførsel til en vesentlig del av nervecellen. Klassisk, blir denne teknikken utført in vitro enten på hjernesnitt, fersk dissosierte neuroner, eller på cellekultur-modeller ^3. Når utført på nevroner i hjernen skiver, presenterer denne teknikken flere fordeler. Spesielt: (i) neuroner tas opp i forholdsvis bevart hjernen kretser som til en viss grad, og sammenlignet med cellekulturpreparater, tilveiebringe et miljø som er fysiologisk relevant ^3. Dette gjør det mulig å fange tidlig, eller til å overvåke i sanntid, cellulære og molekylære hendelser som utløses av en hvilken som helst form for akutt pharmacologiCal manipulasjoner – en tidsmessig oppløsning som ikke kan oppnås ved hjelp av klassisk in vivo forhold; (ii) evne til å visuelt identifisere områder av hjernen i hjerneskiver gir høy regional spesifisitet ³ både for hjernen regionen studert og for bestemte nerveceller når de uttrykker fluorescerende markører; (iii) adgang til det intracellulære rommet i cellen ved å åpne en vesentlig del av plasmamembranen (i motsetning til å punktere membranen med en skarp mikropipette for intracellulære opptak) ^4. I sin tur gir dette innholdet eller konsentrasjon av spesifikke ioner som utgjør intern løsning som skal endres så molekylære mål eller cellulære mekanismene kan studeres under forskjellige forhold. For eksempel: Ved å etablere hel-celle konfigurasjon, noe bestemt medikament (f.eks antagonister) at man kan legge til opptaket mikropipette (patch pipette) løsning vil direkte diffus i cytoplasma og handle på egen putative intracellulære mål uten å endre målet funksjon i nabocellene. I tillegg, sammenlignet med skarp mikropipette opptak, den store åpning ved spissen av patch clamp elektrode gir lavere motstand, mindre konkurrerende støy, og derved bedre elektrisk aksess til innsiden av cellen ^4. Imidlertid merke til at den store åpningen i pipettespissen kan føre til celle dialyse, og derved tap av intracellulær molekylære maskineri som kan være kritisk for ekspresjon av de biologiske fenomener som er under undersøkelse ^5,6. I dette tilfellet kan skarpe elektrode innspillinger være mer egnet. Denne type opptak er det nødvendig mikropipetter med en pore som er mye mindre enn de som brukes for hel-celle-opptak, for derved å hindre det meste av ionebytter mellom intracellulært plass og den indre pipette-løsning.

Enhver form for erfaring (akutt eller kronisk), inkludert læring ^7-10, eksponering for narkotika av misbruk ^11,12, stress ^13,14, etc., kan endre ulike aspekter av neuronal funksjon i bestemte områder av hjernen. Fordi disse endringene krever ofte tid til å utvikle (timer til dager), hel-celle opptak i hjernen skiver fra dyr som har gjennomgått en spesiell opplevelse tillate forskere å identifisere disse endringene. I utgangspunktet, mange (om ikke alle) komponenter som deltar i nervefunksjoner (f.eks ligand-aktiverte ionekanaler, spenningsstyrte ionekanaler, neurotransmitter transportører), og dermed hjernen krets aktivitet og atferd, kan endres av erfaring (erfaring avhengig plastisitet) ^10,15-17. På nevronale nivå, kommer hjernekretsen aktivitet fra konstant interaksjoner mellom synaptic (f.eks glutamat overføring) og iboende cellulære oppstemthet faktorer (f.eks axosomato-dendrittiske ionekanaler: natrium, Na ^+, kalium, K ^+, og kalsium, Ca ²⁺ ). Under spesielle forhold ved hjelp av enge-cell patch-clamp elektroteknikk, signal endringer som stammer spesielt fra endringer i synaptiske vs. iboende oppstemthet kan isoleres.

I de fleste tilfeller er synaptisk eksitabilitet vurderes ved bruk av helcelle-spenningsklemmeteknikken. Dette opptaket Modus tillater måling av ione-strøm [f.eks mediert av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre reseptorer ( AMPA-reseptorer) og N-metyl-D-asparaginsyre-reseptorer (NMDA-reseptorer)] via neuronale plasmamembranen samtidig holder membranpotensialet på en fast spenning. Her experimenters benytte interne Mikropipette løsninger som inneholder cesium (Cs ^+), en bred blokkering av K ⁺ -kanaler (nøkkel iboende oppstemthet faktorer). Ved etablering av hel-celle-konfigurasjon, vil diffusjon av Cs ⁺ i intracellulære rom å blokkere K ⁺ -kanaler, og derved vil tillate både en forholdsvis effektiv plass klemme og prelufte påvirkning av indre oppstemthet faktorer på andre målinger. Space-klemme problemer, dvs. problemer med å spennings klemme hele cellen, oppstår når du spiller inn uregelmessig formede celler (f.eks nevroner), og spesielt nevroner med et stort og komplekst dendrittiske arbor ^18,19. Fordi somatisk spenning klemme dårlig kontroller spenning i dendrittiske tre nevroner, ulike aspekter av dendrittiske elektriske signaler som studeres forvrengt i en dendrittiske avstand avhengig måte. Kombinert med farmakologiske verktøy som pikrotoksin (gamma-aminosmørsyre, GABA _A reseptor-antagonist) eller kynurensyre (bred blokkering av glutamatreseptorer) oppløst i ekstracellulær løsning (kunstig cerebrospinalvæske, ACSF), tillater denne teknikken måling av glutamat reseptor og GABA _A R-mediert strøm henholdsvis.

I kontrast er iboende oppstemthet vanligvis vurdert i dagens-klemme opptaksmodus.I motsetning til spenningsklemmen opptak, lar dette opptaksmodus til måling av variasjoner i membranpotensialer indusert av ione-strømmer som flyter gjennom den nevronale plasmamembranen. Vanligvis er endring i indre oppstemthet vurderes gjennom endringer i evnen til nerveceller til å generere aksjonspotensialer, som krever både Na ⁺ og K ⁺ kanaler. Derfor, når du utfører dagens-clamp opptak, er mikropipetter fylt med en intern løsning som inneholder K ^{+ i} stedet for Cs ^+. Kombinert med farmakologiske midler som blokkerer glutamat og GABA _A reseptor-mediert strøm oppløst i ACSF, tillater denne eksperimentelle konstruksjon til måling av bidraget fra indre faktorer (for eksempel K ⁺ -kanaler) til nevronal utløsning uten å bli forurenset av eventuelle endringer i synaptiske eksitabilitet faktorer.

Denne artikkelen vil beskrive de grunnleggende nødvendige prosessuelle skritt to (i) forberede sunne hjernen skiver; (Ii) å oppnå hel-celle-konfigurasjon, og (iii) å overvåke grunnleggende parametere for å vurdere synaptiske og indre eksitabilitet.

Protocol

Alle forsøk ble utført i henhold til protokollene godkjent av UT South Institutional Animal Care Committee og bruk, og ble valgt for å minimalisere stress, ubehag og smerte som oppleves av forsøksdyrene. 1. Solutions Merk: Forbered Mikropipette interne løsninger på forhånd. For de fleste grunnleggende eksperimentelle formål, bør to typer løsninger nok: Cs + -basert og K + -baserte løsninger. Bruk Cs + -baserte løsninger (for eksempel Cs <su…

Representative Results

Temperatur, en faktor som er lett kontrolleres ved experimenter, påvirker de biofysiske egenskapene til ionekanaler og reseptorer, og derved bølgeformen av post-synaptiske strømmer (pscs) (EPSC og iPSCs), og evnen av nerveceller for å fremkalle pigger. Figur 3 og Figur 4 viser effekten av temperatur på neuronal avfyring og hellingen av fremkalt EPSCs (eEPSCs) respektivt. Skytingen mønster (figur 3) (dvs. ventetid til<…

Discussion

Denne protokollen beskriver den vanlige fremgangsmåten for å utføre hel-celle patch-clamp eksperimenter på nevroner i hjernen skiver. Imidlertid kompleksitet, potensial og følsomheten av denne teknikken kan ikke beskrives fullstendig i denne artikkelen. Her har vi forsøkt å avgrense de mest grunnleggende trinn og understreker viktige parametere som må kontrolleres for å oppnå vellykkede og strenge hel-celle opptak. For ytterligere teoretisk læring, har mange bøker og artikler er publisert på både hel-celle…

Materials

Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4-H20, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H20, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375