Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Summary

Этот протокол описывает основные процедурные шаги для выполнения целой клетки записи патч-зажим. Эта методика позволяет исследовать электрического поведения нейронов, и когда выполняется в срезах мозга, позволяет оценить различные нейронные функции от нейронов, которые до сих пор интегрированы в относительно хорошо сохранившихся контуров мозга.

Abstract

Цельноклеточная записи патч-зажим является электрофизиологические метод, который позволяет исследовать электрические свойства существенной части нейрона. В этой конфигурации микропипетки находится в плотном контакте с клеточной мембраной, которая предотвращает утечку тока и тем самым обеспечивает более точные измерения ионного тока, чем ранее использовавшейся внутриклеточного острого способа записи электрода. Классически, запись поклеточного может быть выполнена на нейронах в различных типах препаратов, в том числе моделей клеточных культур, диссоциированных нейронов, нейронов в срезах мозга, и в интактных анестезированных или бодрствующих животных. Таким образом, эта методика очень способствовало пониманию пассивных и активных биофизических свойств возбудимых клеток. Главным преимуществом этого метода является то, что она предоставляет информацию о том , как конкретные манипуляции (например, фармакологические, экспериментатор-индуцированные пластичностью) могут изменять специфические нейронные функции или Сhannels в режиме реального времени. Кроме того, значительное открытие плазматической мембраны позволяет внутреннее решение пипеткой свободно диффундировать в цитоплазме, обеспечивая средство для введения лекарственных средств, например, агонисты или антагонисты специфических внутриклеточных белков, и манипулировании этих целей , не изменяя их функции в соседних сотах. В данной статье основное внимание будет уделено записи целых клеток проводили на нейроны в срезах мозга, препарат , который имеет преимущество записи нейронов в относительно хорошо сохранившихся контуров мозга, т.е. в физиологически соответствующем контексте. В частности, когда в сочетании с соответствующим фармакологию, этот метод является мощным инструментом, позволяющим идентифицировать конкретных neuroadaptations, которые имели место после любого типа опыта, таких как обучение, воздействие наркотиков злоупотребления и стресса. Таким образом, цельноклеточная патч-зажим записи в срезах мозга обеспечивают средства для измерения в бывших естественных условиях подготовки длительных измененийв нейрональных функций, которые развивались в неповрежденных бодрствующих животных.

Introduction

Метод патч-зажим, электрофизиологическое технология , которая была разработана в конце 1970 – х ^1,2, является основным инструментом для изучения одного или нескольких функций ионных каналов в живой ткани. Среди различных конфигураций накладными, которые могут быть достигнуты, поклеточного патч-зажим записи позволяют исследование электрического поведения значительной части нейроне. Классически, эта техника выполняется в пробирке или на срезах мозга, свеже диссоциированных нейронов, или на моделях клеточных культур ^3. При использовании на нейроны в срезах мозга, эта методика представляет несколько преимуществ. В частности: (I) нейроны записываются в относительно сохраненными участки мозга , которые в некоторой степени, и по сравнению с препаратами для культивирования клеток, обеспечивают среду , которая является физиологически отношение ^3. Это позволяет захватывать рано, или даже мониторинг в режиме реального времени, клеточные и молекулярные события, которые вызываются любым типом острого pharmacologческие манипуляции – временное разрешение , которое не может быть достигнуто с помощью классического в условиях естественных условиях; (б) возможность визуально определить области мозга в срезах мозга обеспечивает высокую региональную специфику ³ как для региона мозга изучены и для конкретных нейронов , когда они выражают флуоресцентные маркеры; ( в ) получать доступ к внутриклеточное пространство клетки, открывая значительную часть плазматической мембраны (в отличие от прокалывания мембраны с резким микропипетки для внутриклеточных записей) ^4. В свою очередь, это позволяет содержание или концентрацию определенных ионов, образующих внутреннее решение, чтобы быть модифицирован таким образом молекулярные мишени или клеточные механизмы могут быть изучены при различных условиях. Например, при создании конфигурации целой клетки, любой специфический фармакологический агент (например, антагонисты) , которые можно добавить к микропипетки записи (патч пипетки) решение будет непосредственно диффундируют в цитоплазму и действовать на его putatив внутриклеточные мишени без изменения целевой функции в соседних ячейках. Кроме того, по сравнению с резким записи микропипетки, большое отверстие в кончике электрода зажим заплата обеспечивает более низкое сопротивление, менее конкурирующими шум, и , таким образом , лучший электрический доступ к внутренней части клетки ^4. Тем не менее, отметим , что большое отверстие в наконечнике пипетки может привести к клеточной диализе, и , таким образом , потеря внутриклеточного молекулярного механизма , который может иметь решающее значение для выражения биологических явлений , которые находятся в стадии изучения ^5,6. В этом случае, острые записи электрода может быть более подходящим. Этот тип записи требует микропипетки с поры, что значительно меньше, чем те, которые используются для записи целых клеток, предотвращая тем самым большую часть ионного обмена между внутриклеточным пространством и внутренним раствором пипеткой.

Любые формы опыта (острый или хронический), в том числе обучение ^7-10, воздействие наркотиков злоупотребления ^11,12, напряжение ^13,14 и т.д., могут изменять различные аспекты функции нейронов в определенных областях мозга. Поскольку эти изменения часто требуют времени для разработки (часов до нескольких дней), записи целых клеток в срезах мозга от животных, которые претерпели определенный опыт позволяют исследователям идентифицировать эти изменения. В принципе, многие (если не все) компонентов , которые участвуют в нейрональных функций (например, лиганд-активированных ионных каналов, напряжения закрытого ионных каналов, нейромедиаторных транспортерные), и , таким образом , цепь активности мозга и поведение, могут быть изменены с помощью опыта (зависящий от опыта пластичность) ^10,15-17. На нейронном уровне, схема активность мозга возникает из постоянных взаимодействий между Synaptic (например, передачи глутамат) и внутренних факторов , клеточная возбудимость (например, axosomato-дендритных ионных каналов: натрий, Na ^+, калия, K ^+, а также кальция, Ca ²⁺ ). При определенных условиях с использованием WholE-Cell патч-зажим электрофизиологические методы, сигнальные изменения, происходящие в частности, от изменений в синаптической против собственного возбудимости может быть выделен.

В большинстве случаев синаптическую возбудимость оценивается с использованием цельноклеточной метода фиксации. Этот режим записи позволяет измерять ионные токи [например, опосредованных рецепторами α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты ( АМРА-рецепторов) и рецепторов N-метил-D-аспарагиновой кислоты (NMDA-рецепторы)] через нейронную мембрану плазмы, удерживая мембранный потенциал на установленном напряжении. Здесь, экспериментаторы используют внутренние решения микропипетка , которые содержат цезий (Cs ^+), широкий блокатор K ⁺ каналов (ключевые внутренние факторы возбудимость). При создании конфигурации целых клеток, диффузия Cs ⁺ в межклеточном пространстве будет блокировать K ⁺ каналы, и тем самым позволит как относительно эффективное пространство-зажим и предварительноотдушина влияние внутренних факторов на возбудимость других измерений. Вопросы Пространственно-зажим, то есть трудность напряжения-зажим вся клетка, возникают при записи неправильной формы клетки (например, нейроны) и особенно нейроны с обширной и сложной дендритов ^18,19. Поскольку соматический зажим напряжение плохо контролирует напряжение в дереве дендритов нейронов, различные аспекты дендритных электрических сигналов исследуемых искажаются в дендритной расстояния-зависимым образом. В сочетании с фармакологическими средствами , такими как пикротоксином (гамма-аминомасляная кислота, ГАМК антагонист рецепторов) или кинуреновой кислоты (широкий блокатора рецепторов глутамата) , растворенного во внеклеточном растворе (искусственный спинномозговой жидкости, ACSF), эта методика позволяет измерять глутамата ГАМК и рецептором _A R-опосредованной токи , соответственно.

В противоположность этому, внутренняя возбудимости обычно оценивается в режиме записи ток-зажим.В отличие от записи напряжения зажимом, этот режим записи позволяет измерять вариации мембранных потенциалов, вызванных ионных токов, протекающих через нейронную мембрану плазмы. Как правило, изменение в собственном возбудимости оценивается через изменения в способности для нейронов генерировать потенциалы действия, которые необходимы как Na ⁺ и K ⁺ каналы. Таким образом, при выполнении текущего хомута записи, микропипетки заполнены внутренним раствором , который содержит K ⁺ вместо Cs ^+. В сочетании с фармакологическими препаратами , которые блокируют глутамата и ГАМК токи рецептор-опосредованной , растворенные в ACSF, этот экспериментальный дизайн позволяет измерять вклад внутренних факторов (например, K ⁺ каналов) к нейрональной обжиге без загрязнена потенциальных изменений в синаптической возбудимости факторы.

В этой статье будут описаны основные необходимые процедурные шаги то (я) подготовить здоровые срезах мозга; (II) достижения конфигурации целой клетки, и (III) осуществляет мониторинг основных параметров для оценки синаптических и внутреннюю возбудимость.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Institutional уходу и использованию животных комитета Техасском путем, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных. 1. Решения Примеч…

Representative Results

Температура, фактор , который легко управляется экспериментатором, влияет на биофизические свойства ионных каналов и рецепторов, и , таким образом , форма волны постсинаптических токов (ЧОК) (EPSC и иПСК) и способности нейронов , чтобы вызвать спайки. Рисунок 3 и н…

Discussion

Этот протокол описывает основные процедуры для выполнения целого клеточных экспериментов патч-зажим на нейроны в срезах мозга. Однако сложность, потенциал и чувствительность данного метода не может быть полностью описана в этой статье. Здесь мы попытались обрисовать самые основные ш…

Materials

Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4-H20, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H20, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375