생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

요약

이 원고는 말기 감염을 추적하기 위해 아프리카 트리파노좀의 생물 발광 균주를 사용하는 방법을 설명하고 in vivo 라이브 이미징을 사용하여 중추 신경계 내의 감염을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

초록

인간 아프리카 트리파노소마증(HAT)은 기생충이 중추신경계(CNS)에 침입하는 초기 혈액 단계와 후기 단계의 두 단계로 나타나는 다단계 질병입니다. 후기 단계의 생체 내 연구는 전통적인 방법론이 기생충의 존재를 결정하기 위해 뇌를 제거해야 하기 때문에 제한적이었습니다.

Bioluminescence 이미징은 루시페라아제에 의해 transfected 병원체를 실시간으로 시각화할 수 있는 비침습적이고 매우 민감한 형태의 광학 이미징입니다. 생쥐에서 말기 질환을 일으킬 수 있는 형질주입된 트리파노솜 균주를 사용함으로써, 감염 과정 전반에 걸쳐 단일 동물에서 중추신경계 감염의 동역학을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 전신 감염의 이동 및 전파를 관찰할 수 있습니다.

여기에서는 아프리카 트리파노소마증의 생물 발광 모델을 사용하여 CNS 감염을 연구하기 위한 강력한 프로토콜을 설명하며, 선택적 다운스트림 접근 방식으로 추가로 분석할 수 있는 실시간 비침습적 관찰을 제공합니다.

서론

Human African trypanosomiasis (HAT) 또는 수면병은 Trypanosoma brucei spp¹의 매개체 매개 원생동물 기생충에 의해 발생합니다. 현재 추정 감염 사례는 매년 7,000명 미만으로 추산되며, 아프리카 대륙 내에서 거의 7,000만 명의 사람들이 기생충 감염 위험에 노출되어 있습니다. 치료하지 않고 방치할 경우 가장 치명적일 수 있는 이 질환은 혈액에 기생충이 존재하는 초기 혈림프계로 구성되며, 기생충이 중추신경계(CNS)에 침입하여 더 이상 초기 트리파노솜 약물로 치료할 수 없는 말기로 진행된다². 말기 HAT에 대한 현재의 약물 요법은 복잡하고 장기적인 치료 요법과 심각한 부작용 및 보고된 내성을 모두 가지고 있으므로 새로운 약물 요법에 대한 연구가 필수적입니다^3,4.

전통적인 마우스 모델 내에서 말기 인간 아프리카 트리파노소마증(HAT)에 대한 연구는 길고 복잡하며, 기생충 부담을 모니터링하기 위해 뇌 조직을 제거해야 합니다⁵. 동물 감염성 균주 T. b. brucei는 트리파노소마증의 연구 모델로 사용되며 후기 단계는 감염 후 21일(dpi)에 나타납니다. 마우스 모델에서 야생형 비생물....

프로토콜

윤리학
모든 작업은 영국 홈 오피스 동물의 승인 (과학적인 절차) 법 1986 위생 및 열대 의학 동물 복지와 윤리 심의위원회의 런던 학교에서 실시 하였다. 가이드 라인에 도착하는이 보고서에 따른다.

발광 생물 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei의 생체 항로 1.

1. T.의 냉동 보관 재고 (라고 stabilate)를 제거 비. brucei 변형 액체 질소에서 ⁹ (MTA를 통해 위생 및 열대 의학의 런던 학교 교수 존 켈리에서 구입 가능) GVR35-VSL-2 및 실온에 평형 수 있습니다. 멸균 인산 완충 포도당 식염수 (PBS-G)의 pH 8.0 (1 L PBS + 15g 포도당) ^(10)에 2 × 10 ⁴ 트리 파노 솜 / ㎖로 stabilate을 희석.
   참고 : T.를 비. brucei GVR35-VSL-2는 인간에게 비 감염성이며 SAPO 실험을 수행 할 시설 허가가 필요합니다.
2. INJ요법 25 G 바늘로 복강 내 경로 (IP)를 통해 trypanosomes에 희석 0.2 ml의와 20-25g 여....

결과

이 프로토콜은 T.와 마우스의 감염 다음 질병의 진행을 수행하는 방법을 보여줍니다 비. brucei는 인간의 아프리카 트리파노소마 증의 모델이. 그림 1 치료 및 이미징 단계의 시간표를 보여주는 실험 프로토콜의 타임 라인을 보여줍니다.이 주변 기생충을 정량하는 데 사용되는 고정 김사 묻은 혈액 도말 검사에서보기의 전형적인 필드를 보여줍니다 그림, 트리 파노 솜과 적혈구 현재와. 동물에서 감염의 개발은 각 시점에서 이미징 된 동일 동물 실험의 과정을 통해 감염된 동물을 보여준다도 3에서와 생물 발광 측정 하였다 될 수있다. 감염 신호 개 파종하고 강렬한대로 생물 발광의 증가 BLI 높은 영역으로, 제 이십일일 통해 모든 동물에서 관찰 될 수있는 과정을 통해 (적색으로 표시비장 지역에서) 열지도 축척에서. .......

토론

생물 발광의 T. 개발 비. brucei GVR35 변형 후반 단계에 이른에서 트리파노소마 감염의 시각화 할 수 있습니다. 이전 감염 모델 기생충은 뇌에있는 경우 혈액 막 현미경에서 실시간으로, 말기를 검출 할 수 없었다 및 기생 부하 ^(12)를 결정하기 위해 감염된 마우스에서 뇌의 컬링 및 제거가 필요했다. 하나의 마우스 감염의 전체 및 모든 단계에서 관찰 할 수 감염의 빠른 질적 평가를 통해 추적 할 수 있습니다 같이 생물 발광 간 마우스 변동성을 줄일 수 있습니다. 생물 발광 영상의 매우 민감한 방법은 낮은 수준의 감염이 현미경 ⁹ ml의 검출 5 × 10 ³ trypanosomes에 / 비교 영상을 통해 검출 적은 100 trypanosomes에 함께 혈액 영화 현미경보다 일찍 식별 할 수 있습니다. 또한, 실험 전반에 걸쳐 동일한 동물에 이어 제거큰 동물의 사용량을 줄이는 각 시점에 대한 별도의 동물 집단에 대한 필요성이야. <.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS	Sigma, UK	P4417	정제 pH 7.4
포도	Sigma, UK	G8270	99.5%(분자) 등급
염화암모늄	Sigma, UK	A9434	99.5%(분자) 등급
헤파린(리튬 염)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	멸균 여과
Mr. Frosty	Nalgene, 영국
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	분석 등급
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, 영국		독점 소프트웨어에서 사용 가능한 기타 바이오이미저e.
		기기에는 자체
	Greiner Bio-one	N2516
21G 바늘	Greiner Bio-one	N2138
트윈 프로스트 현미경 슬라이드	VWR, UK	631-0117
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	StarLab, UK	I1415-1000
7ml 비주관	StarLab, UK	E1412-0710
마우스 리트레이너	Sigma, 영국	Z756903	우리의 구속기는 사내에서 제작되었으며 유사한 모델입니다.

당 Bruker, Kodak Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, Perkin Elmer, Perkin Elmer IVIS 기기용 영국 다른 1ml 주사기 Fisher Scientific, 영국 10142104 20ml 주사기 Fisher Scientific, 영국 10743785 25G 바늘이 있을 수 있습니다.