여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
기본 장 organoids 크게 점막 면역학 분야에 영향을 미칠 수있는 유용한 모델 시스템이다. 그러나, organoid 성장 특성의 복잡성은 연구자에 대한 상당한주의를 실시하고 있습니다. 특히, 각각의 organoid의 성장 패턴은 매우 다양하며, 문화 상피 세포의 이종 인구를 만듭니다. 이러한주의 사항과 함께, 일반 조직 배양 방법은 단순히 의한 세포 구조의 복잡성으로 organoid 시스템에 적용 할 수 없다. 일부 정규화 기술을 적용하지 않는 계산 및 세포주 개별적으로 분리 된 셀에 대해 공통 셀 번호만을 기준 도금 organoids위한 신뢰할 수있는 방법이 아니다. 총 단백질 함량 정규화 때문에 거주자 단백질 매트릭스 복합체 이루어진다. 분비 된 콘을 평가할 때 세포 수, 형상 및 세포 형태 측면에서 이러한 특성은 고려되어야organoid 질량에서 텐트. 이 프로토콜은 문화 간단한 절차를 간략하게 설명하고 미생물 병원체 및 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)에 소장 organoids을 치료하기 위해 생성되었습니다. 또한 단백질 분석은 이러한 공격 후 수행 할 때 적용해야 정규화 기술을 강조한다.
서론
능력은 수확과 문화 차 organoids 조직 생물학 1-5에 대한보다 생리 학적으로 대표 현상을 이해하는 데 밀접한 흥미로운 발전 소장, 대장, 췌장, 간, 뇌에 대해 설명하고 있습니다되었습니다. 소장 organoids의 문화 및 유지 보수를 설명하는 첫 번째 방법은 사토 등의 알에 의해보고되었다. 한스 Clevers 1의 실험실에서. 이 방법, 수확 및 입증 차 장 상피 세포의 배양에 앞서 제한 상피 세포 성장 유지에 효과가있다. 방법은 궁극적으로 혼합 차 섬유 아세포 (6)의 부산물로 이어질 것 같은 콜라게나 제와 디스 파제 등의 효소와 함께 배양을 통해 조직의 분리를 포함했다. 이러한 조건은 또한 시간은 상피 세포 배양을 지속 제한 될 것이다. 상피 세포로 인해 세포 사멸을 입력으로 더 상피 세포 틈새에 최소가 형성 것적절한 성장 인자 또는 접촉 무결성 손실의 부족 anokis 7 불린다. 입체 · organoid 배양 시스템의 출현은 지속적인 배양 한 장내 세포 유형의 스펙트럼을 포함하는 일차 배양 장 세포에 대한 방법을 제공했다. 이러한 상피 organoids들은 여러 분화 세포로 구성되어 있음되는 세포주에 비해 많은 장점을 가지고, 그들이보다 생체 ....
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프로토콜
모든 연구는 승인 버지니아 공대 IACUC 지침에 따라 수행 하였다
1. R-Spondin1이 HEK293T-Rspo1 세포주에서 미디어 금연실 준비
- HEK293T-Rspondin1 세포의 생성 이전에 10을 설명 하였다. 시드 HEK293T-Rspondin1은 1X 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 40 mL의 + 10 % 태아 소 혈청 (와 T-175 플라스크에서, 약 5-10 %의 컨 플루 언시에 8 × 105 -1.7 × 106 세포를 세포 분비 성장 매체와 같은 FBS), 37 ° C + 5 % CO 2 부화.
참고 : R-spondin1 에어컨 미디어의 역할을 할 HEK293T-Rspondin1 분비 세포의 성장 미디어. R-spondin1 대안 ng를 500 / ml의 최종 농도로 사용하는 재조합 성장 인자로 구입할 수있다. - 이레 동안 또는 시야 현미경으로 결정된 95 % 포화 상태에 도달 할 때까지 - Rspondin1 HEK293T 세포 성장. 50에 컨디셔닝 미디어 및 전송의 40 ml의 수확ML 원뿔 튜브. HEK293T-Rspondin1 분비 세포의 T-175 플라스크를 폐기하십시오.
- 원심 분리기는 4 °....
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결과
장 organoids을 육성하기 위해이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 특성 구 모양의 organoids는 수확 후 존재합니다. R-spondin1 에어컨 미디어의 추가는 매일 organoids의 성장과 신진를 시작합니다. organoids의 성장은도 1a에 도시되어있다 - F, 및 일 1, 2, 4, 5, 6 일에 장내 organoids 대표 인 14도 1F는 14 일째 organoids의 비 균일 한 성장 특성을 나타낸다.
organoids는 적절한 수의 성장되면, 그들은 플레이 팅과 다양한 PAMPs가 및 / 또는 미생물에 도전 할 수있다. 발현 분석은 표준 기술을 통해 수행 될 수있다. 이는 다음 분석 하였다 염증성 사이토 카인 IL-.......
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토론
장 organoids의 문화 및 유지 보수 적절한 조직 배양 기술로 개별 마스터 할 수있는 절차입니다. 이보다 기존의 단일 층의 세포 성장에 비해 계대에 미묘한가 있지만, 이러한 미묘한 차이는 극복하기 어려운되지 않습니다. 이 방법의 중요한 단계는 최적의 파종을 위해 충분히 높은 밀도로 organoids 성장을 할 수있는 포함한다. 통상적으로 세포주를 달성 할 수있다 큰 파종 밀도가 실질적으로없는 실험 organoids으로 축소되어야한다. 여러 처치 군이 존재하는 경우에 특히 분명해진다.
이 프로토콜은 다양한 박테리아의 다양한 장내 상피 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 단계별 방식을 제공하기위한 것이다 정규화에 대해이 시스템을 사용하여 바이러스, 진균 병원체뿐만 아니라 어드레스 어려움. 보고서는 describ 사용할 수 있습니다전자 세균성 병원체 살모넬라 균과 장 organoids의 상호 작용, 아직 분비되는 사이토 카인.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 기술적인 토론에 대해 Sheryl Coutermarsh-Ott 박사, Dylan McDaniel 및 Bettina Heid에게 감사를 표합니다. 저자는 Caco-2 세포를 제공한 Nanda Nanthakumar 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 버지니아 공대의 다문화 학업 기회 프로그램(MAOP)에 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립당뇨병·소화기·신장 질환 연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award)의 지원을 받아 K01DK092355(I.C.A.에)를 수여했습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소 태아 혈청 (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (섹션 1,3,6) 또는 동등한 브랜드 |
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| HEK293T-Rspondin1 분비 세포주 | (섹션 1) Kim, K.A. et al.에서 설명 및 수정됨. GeneCopoeia에서 맞춤 주문 및 구매한 pReceiver-Lv105 백본에 복제된 RSPO1(NM_138683) ORF cDNA를 포함하는 렌티바이러스 입자. | ||
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 352070 | (Section 1) 또는 동등한 브랜드 |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) 또는 동등한 브랜드 |
| 단백질 매트릭스 | Corning | 356231 | (섹션 2,3,4,5,6) Matrigel 성장 인자 감소 |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE 헬스케어 | SH30264.01 | (섹션 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (섹션 2,3) 고급 DMEM/F12 |
| Corning 24 웰 TC 플레이트 | Corning | 3524 | (섹션 2) |
| N2 보충제 100x | Life Technologies | 17502-048 | (섹션 2) |
| B27 비타민 A 없음 50x | 라이프 테크놀로지스 | 12587-010 | (제2항) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2)은 Advanced DMEM/ F12 |
| hepes (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2)은 Advanced DMEM/ F12와 결합할 수 있습니다. |
| 10ml 혈청 학적 Pipet | Falcon | 357551 | (섹션 2) 또는 동급의 브랜드 |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (섹션 2) 재고 = 100 mg / ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (섹션 2) 재고 = 1M |
| 재조합 마우스 EGF | Biolegend | 585608 | (섹션 2) 재고 = 500 mg / ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (섹션 3) | |
| 해부 가위 | (섹션 3) | ||
| 펜치 | (섹션 3) | ||
| 유리 슬라이드 | (섹션 3) | ||
| 해부 핀셋 | (섹션 3) | ||
| 25 ml 혈청학 피펫 | 팔콘 | (섹션 3) | |
| EDTA | 시그마 Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M 또는 대안적인 TC 등급 EDTA |
| 메마른 페트리 접시 100mm x 15mm | 피셔 | FB0875712 | Section 3) 또는 동등한 크기의 TC 접시 |
| 1ml 주사기 | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| 정밀 글라이드 바늘 | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) Bacillus subtilis에서 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| 편모 | 인비보젠 | tlrl-bsfla | (섹션 5,6) |
| 리스테리아 모노사이토제네스 | ATCC | 19115 | (섹션 5,6) ( 머레이 et al.) |
| 혈액 분석기 | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA( | Section 5,6) 또는 동등한 브랜드 |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065(Section 5) | |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (섹션 6) |
| 메탄올 | 피셔 | A412-4 | (섹션 6) |
| SpectraMax M5 | 몰레쁠 장치 | (섹션 6) | |
| 96 웰 분석 플레이트 | Corning | 3603 | (섹션 6) 블랙 플레이트, 투명 바닥 TC 처리 |
| 핵 염색 염료 | Life Technologies | H1399 | (섹션 6) Hoechst 33342 |
| T-75 플라스크 | Corning | 430641 | (Section 6) 또는 동등한 브랜드 |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 352096 | (Section1,3) 또는 동등한 브랜드 |
| 1.7 ml 폴리프로필렌 튜브 | Bioexpress | C-3262-1 | 또는 동등한 브랜드 |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | 또는 동등한 브랜드 |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman 유전자 발현 분석 키트 |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman 유전자 발현 분석 키트 |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman 유전자 발현 분석 키트 |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman 유전자 발현 분석 키트 |
| 18s | Applied Biosystems | Hs | 99999901_s1 Taqman 유전자 발현 분석 키트 |
| 7500 Fast Real Time PCR 시스템 | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA 역전사 키트 | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | ||
| 재조합 마우스 R-Spondin 1 단백질 | R& D 시스템 | 3474-RS-050 | 500ng/ml |
| 클로로포름 | 시그마-알드리치 | C7559 |
참고문헌
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- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelia....
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재인쇄 및 허가
