Summary

Generering av organkonditionerade media och applikationer för att studera organspecifika influenser på bröstcancer Metastatisk Behavior

Published: June 13, 2016
doi:

Summary

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Abstract

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Introduction

Bröstcancer är den vanligaste diagnostiserade cancerformen hos kvinnor och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall 1. Bröstcancer höga dödligheten är främst på grund av fel i konventionell behandling för att minska och eliminera metastatisk sjukdom; ungefär 90% av cancerrelaterade dödsfall beror på metastaser 2. Att förstå de underliggande molekylära mekanismerna för metastaserande kaskad är avgörande för utvecklingen av läkemedel effektiva i både tidigt och sent skede bröstcancer.

Tidigare forskning har bidragit till att belysa den flerstegs karaktär av bröstcancer metastaser och det antas att resultatet av både cancer progression och metastasering är till stor del beroende på samspelet mellan cancerceller och värdmiljön 3. Kliniska observationer tyder på att många cancerformer visar organ tropism, dvs. Tendensen att företrädesvis metastasera till specifika organs.In CASe av bröstcancer, sprider en patients sjukdom typiskt eller sprider sig till 5 viktigaste platserna, inklusive ben, lungor, lymfkörtlar, lever och hjärna 4-6. Många teorier har utvecklats för att förklara denna process, men bara ett fåtal har stått emot tidens tand. Ewings teori om metastas, som föreslås i 1920-talet, hypotesen thatthe distribution av metastaser var strikt på grund av mekaniska faktorer; varigenom tumörceller sker i hela kroppen av normala definierade fysiologiska blodflödesmönster och helt enkelt stoppa i första kapillär sängen de möter 7. I motsats, Stephen Pagets 1889 "utsäde och jord" hypotes föreslog att ytterligare molekylära interaktioner var ansvariga för överlevnad och tillväxt av metastaser, varigenom cancerceller ( "frön") endast kan etablera sig och proliferatein organmikromiljöer som producerar lämpliga molekylära faktorer ( "jord ") 8. Nästan ett sekel senare, Leonard Weiss enligttog en meta-analys av tidigare publicerade obduktions uppgifter och bekräftade Ewings förutsägelse som många metastaserande tumörer som upptäcks vid obduktion hittades i de förväntade proportioner som skulle förväntas om metastatisk organ tropism bestämdes genom blodflödesmönster ensam. Men i manyinstances det fanns färre eller fler metastaser bildas vid vissa platser då kan förväntas av Ewings föreslagna mekaniska faktorer 9. Dessa konton och teorier tyder på att specifika mikromiljöer organ spelar en avgörande roll i spridningsmönster och efterföljande tillväxt och överlevnad av många cancerformer, bland annat bröstcancer.

Tidigare forskning har främst fokuserat på tumörcells härledda faktorer och deras bidrag till organ tropism observerats vid bröstcancer metastaser 10-12, men lite forskning har undersökt faktorer som härrör från orgelmikro som kan ge en gynnsam nisch för inrättandetav bröstcancermetastaser. Detta är till stor del tillskrivas de tekniska utmaningarna att studera komponenterna i orgelmikro in vitro.

Den aktuella artikeln beskrivs en omfattande ex vivo modellsystem för att studera påverkan av lösliga komponenter i lymfkörtel, ben, lunga och hjärna på den metastatiska beteendet hos humana bröstcancerceller. Tidigare studier har validerat detta modellsystem genom att visa att olika bröstcancercellinjer visar cellinje specifik och organspecifika malignt beteende som svar på organkonditionerade media som motsvarar deras in vivo metastatisk potential 13. Detta modellsystem kan användas för att identifiera och utvärdera specifika organhärledda lösliga faktorer som kan spela en roll i den metastatiska beteendet hos bröst- och andra typer av cancerceller, inklusive påverkan på tillväxt, migration, stjälkliknande beteende och genuttryck, samt identifiering avpotentiella nya terapeutiska mål för cancer. Detta är den första ex vivo modellsystem som kan användas för att studera organspecifik metastatisk beteende i detalj och för att utvärdera rollen av organhärledda lösliga faktorer i att driva processen för cancermetastas.

Protocol

Alla djurstudier genomfördes i enlighet med rekommendationerna från den kanadensiska rådet om Animal Care, enligt protokoll som godkänts av Western University Animal Använd underutskott. 1. Organ Isolering (lunga, hjärna, ben, lymfkörtel) Förbereda fyra sterila 50 ml koniska rör (en för varje organ som skall isoleras) innehållande approximativt 30 ml sterilt fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Pre-väga varje rör av PBS med användning av en elektronisk våg. A…

Representative Results

Generering av Organkonditionerade medier Ett översiktsschema / schematisk vy av processen för organ isolering och generering av konditionerade media presenteras i fig 1, med representativa fotografiska bilder av det förfarande som visas i figur 2. Det bör noteras att när detta protokoll var först under utveckling, var levern ingår i vår analys eftersom…

Discussion

Metastas är en komplex process genom vilken en serie av cellulära händelser är ytterst ansvarig för vävnadsinvasion och avlägsna tumören etablering 4,30,31. Ex vivo modellsystem som presenteras här kan användas för att studera två viktiga aspekter av metastasutvecklingen: cancercell målsökande eller migrering till ett visst organ ( "Tvillingarna") och tillväxt i detta organ ( "växer där"). Många studier har tidigare fokuserat på att identifiera viktiga molekylä…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, the Canada Foundation for Innovation (No. 13199), and donor support from John and Donna Bristol through the London Health Sciences Foundation (to A.L.A.). Studentship and fellowship support were provided by the Ontario Graduate Scholarship program (Province of Ontario, to G.M.P. and J.E.C.), the Canada Graduate Scholarship-Master’s program (to M.M.P), the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (to M.M.P., G.M.P and J.E.C.) and the Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit at the London Regional Cancer Program (to M.M.P., G.M.P., J.E.C. and Y.X.). A.L.A. is supported by a CIHR New Investigator Award and an Early Researcher Award from the Ontario Ministry of Research and Innovation.

Materials

50 ml conical tubes Thermo Scientific (Nunc) 339652 Keep sterile
1X Phosphate-buffered saline ThermoFisher Scientific 10010-023 Keep sterile
Nude mice Harlan Laboratories Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu Use at 6-12 weeks of age
Polystyrene foam pad N/A N/A The discarded lid (~4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps Fine Science Tools 11050-10 Keep sterile
Scissors Fine Science Tools 14058-11 Keep sterile
Gauze pads Fisher Scientific 22-246069 Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes Sigma-Aldrich CLS7016560 Keep sterile
Scalpel blades Fisher Scientific S95937A Keep sterile
DMEM:F12 Life Technologies 21331-020 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
1 x Mito+ Serum Extender BD Biosciences 355006 Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140-122 Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Life Technologies 11875-093 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051-500ML Keep sterile
Trypsin/EDTA solution ThermoFisher Scientific R-001-100 Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile 
6-well tissue culture plates Thermo Scientific (Nunc) 140675 Keep sterile
0.22 μm syringe filters Sigma-Aldrich Z359904 Keep sterile
T75 tissue culture flasks Thermo Scientific (Nunc) 178905 Keep sterile
Transwells Sigma-Aldrich CLS3464 Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1 R&D Systems FAB1226P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105 R&D Systems FAB1320P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29 R&D Systems FAB2405P-025 use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73 R&D Systems FAB4488P use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44 R&D Systems MAB6127-SP use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45 eBioscience 11-0451-81 use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38 eBioscience 12-5381-80 use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250  Keep sterile
Protein arrays RayBiotech Inc. AAM-BLM-1-2 Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
  3. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  4. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  6. Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278 (1928).
  7. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
  8. Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
  9. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  10. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  11. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  12. Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), (2014).
  13. Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
  14. Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
  15. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  16. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
  17. Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
  18. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
  19. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
  20. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
  21. Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
  22. Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
  23. Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)–an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
  24. Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
  25. Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805 (2014).
  26. Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
  27. Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
  28. Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
  29. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
  30. Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
  31. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
  32. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  33. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
  34. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  35. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
  36. Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).
check_url/kr/54037?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Piaseczny, M. M., Pio, G. M., Chu, J. E., Xia, Y., Nguyen, K., Goodale, D., Allan, A. Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior. J. Vis. Exp. (112), e54037, doi:10.3791/54037 (2016).

View Video