Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.
Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating “experimental” metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.
En metastase er viktig dødsårsak blant pasienter med ondartede sykdommer. Prosessen med metastatisk spredning av kreftceller er dårlig forstått, men ser ut til å involvere flere trinn, inkludert invasjon av tilstøtende vev, intravasation inn i lymfekjertlene og blodkar, overlevelse og trans i sirkulasjonssystemet, bloduttredelse fra blodkar på stedet av metastaser, tilpasning til den nye mikromiljøet av det nye området, og kolonisering på det nye området ved spredning og dannelse av sekundære svulster. 1 Hver av disse biologiske hendelsene involverer transformasjon, formidling og overlevelse av metastatiske tumorceller. For eksempel, transformasjonen av den epiteliale fenotype av tumorcellen inn i et mesenchymale fenotype, kombinert med den vellykkede interaksjon med ekstracellulære matriks, sette dem i stand til å invadere tilstøtende vev og metastasere til andre deler av kroppen. 2,3 Videre er disse metastatisk cellermå overleve i det sirkulerende blodet og unngå immun overvåking fra verten. 4,5 Til slutt, når implantert i et fjernt område i kroppen, må svulstcellene tilpasse seg deres mikromiljø for å spre seg og danne sekundære svulster. 6,7 Derfor , selv om metastase er et vanlig fenomen blant kreftpasienter, metastatiske tumorceller har flere områder av sårbarhet som er mottagelig for terapeutisk intervensjon.
Gitt den immunogene natur melanom, og den nylige interesse for immunterapi, modeller for melanom er stadig mer nyttig. 8 I USA alene, er melanom årsaken til anslagsvis 9000 dødsfall per år. 9 Vanlige steder av melanom metastaser er bein, hjerne , lever og lunger. Flertallet av metastaser til fjerne områder forekommer gjennom blodet. Sirkulerende tumorceller i blodet må unngå immunbehandling, nå en kapillær seng av en distal organ oginvadere gjennom endotelceller i blodkaret for å kunne etablere seg. 4-7,10, 11
Å etterligne de vanlige og virulente fenomener av metastasering ble murine B16-BL6 cellelinje opprettet. En avdøde av foreldre C57BL / 6 melanomcellelinje B16-F0, er B16-BL6 sluttproduktet av 10 på hverandre følgende utvalg for lungemetastase fra intravenøs injeksjon (noe som resulterer i B16-F10), etterfulgt av 6 påfølgende valg av blæren membrangjennomtrengning. 12 Som sådan er det en pålitelig melanomcellelinje for etablering av metastaser i mus, spesielt når den injiseres intravenøst. 13
Etter injeksjon av en tilstrekkelig mengde av B16-BL6-celler i halevenen til en B57BL / 6 mus, etterfulgt av to eller flere uker for å tillate implantasjon og vekst av B16 / BL6-celler vil danne metastaser i lungene. Ved aktiv dødshjelp og inspeksjon av dissekere mikroskopi, antallenkelte foci stede kan kvantifiseres. Dette i sin tur kan brukes til å etablere en dose-effekt metastase, ettersom antallet av injiserte B16-BL6-celler korrelerer med antall foci som dannes på overflaten av lungene. Denne modellen er kjent som "eksperimentell metastase", der kjente-metastatisk celler innføres direkte inn i blodet, som muliggjør rask og forutsigbar spredning og etablering i lunger, lever, eller andre organ for etterforskning. Dette står i kontrast til "spontan metastase," hvor tumorcellene er implantert, ofte subkutant, og metastaser stammer fra organisk felle kreftceller. 14,15
Det er viktig å injisere en passende mengde av B16 / BL6-celler inn i halevenen hos musene. For mange, og lungene vil bli dekket med metastaser og nabobrennpunktene vil være umulig å skille fra hverandre. For få, og påvirkning av en terapeutisk middel vil være umerkelig skyldes iboende variasjon mellom injeksjoner. For å oppnå et optimalt antall foki i lungene av C57BL / 6-mus, er det nødvendig å korrelere antallet av injiserte celler med mengden av etablerte metastaser på overflaten av lungene mens man tar hensyn til den distinguishability av individuelle foci. Denne protokollen vil demonstrere en metastatisk murine melanoma modell for C57BL / 6 mus.
Sirkulerende tumorceller fra en halevene injeksjon representerer metastaser som unndrar områder av primær vekst og migrere gjennom rutene som blodet eller lymfesystemet, av og til å etablere seg i de kapillære senger av fjerne steder. 14 Protokollen er beskrevet ovenfor tjener som en modell for videregående metastaser. Med et optimalt antall B16-BL6 celler injisert, kan forskere fastslå den relative effekten av en administreres narkotika eller immuncellepopulasjonen, post-nøytralisering, på kreftcelle metastasering.
Denne protokollen har begrensninger. De sirkulerende tumorceller har blitt valgt for sin evne til å metastasere, og er derfor ikke-immunogent, som har lavere nivåer av store histokompatibilitetskompleks klasse 1-molekyler. 12 Videre er den plutselige og klynge innføring av store antall metastaser i motsetning til den typiske situasjonen hos pasienter hvor lite antall metastatiske tumorcellerspre over en lengre tidsperiode fra primærtumor sted. I tillegg er innført intravenøst tumorcellene fra vevskultur og ikke av en primær tumor opprinnelse. Derfor er disse cellene er i motsetning til de sekundære metastaser som følge av endringer i celle-adhesjon, migrasjon, immungjenkjennelse og mottaker organ etablering. 15,16
En alternativ protokoll vil være den subkutane injeksjon av B16 / BL6 for generering av primære tumorer og analyse av de resulterende "spontane" lungemetastaser. Disse "spontane" metastaser har vist seg å inneholde mer heterogenitet enn sine "eksperimentelle" kolleger, nærmere matche de av menneskelige pasienter. Protokollen er å begrense dens evne til å bestemme innvirkningen av en eksperimentell forbindelse med metastasering. Med en lateral halevene-injeksjon, kan antallet melanoma celler injisert inn i blodstrømmen approksimeres via hemocytometer. Med "spontane" metastaser, men det er større heterogenitet mellom svulster, legge til en ekstra variabel til antall resulterende lunge brennpunkter. 16
Som konklusjon, halevenen B16-BL6 murin melanom-modellen representerer en enkel modell for å bestemme innflytelsen av en behandling eller immunterapi på metastasering. Ved intravenøs injeksjon av sirkulerende svulstceller, kan forskere replikere i en viss grad, pasienter post-metastasering. Vurderer de destruktive effektene av metastatiske tumorceller i cancerpasienter, er denne modellen et kraftig verktøy for å forstå flertrinnsfremgangsmåte for metastasering.
The authors have nothing to disclose.
Støttet delvis av en National Cancer Institute stipend 1R03CA172923.
Trypsin | Corning | MT25052CV | |
RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |