Uttrykk og rensing av viruslignende partikler for vaksinasjon

Summary

Her presenterer vi en protokoll for syntetisering av viruslignende partikler ved bruk av enten baculovirus eller pattedyrekspresjonssystemer, og ultrasentrifugering rensing. Denne meget tilpass tilnærming blir brukt til å identifisere virale antigener som vaksine mål på en sikker og fleksibel måte.

Abstract

Viruslignende partikler (VLP) og subviral partikler (SVPs) er en alternativ tilnærming til virusvaksine design som gir fordelene av økt biosikkerhet og stabilitet over bruk av levende patogener. Ikke-smittsomme og selvsammen er VLP brukes til å presentere strukturelle proteiner som immunogener, utenom behovet for live patogener eller rekombinante virale vektorer for antigen levering. I denne artikkelen viser vi de ulike stadier av VLP design og utvikling for fremtidige applikasjoner i prekliniske dyreforsøk. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: valg av antigen, ekspresjon av antigenet på cellelinjen av valg, rensing av VLP / SVPs, og kvantifisering for antigen dosering. Vi demonstrerer bruk av både pattedyr- og insektcellelinjer for ekspresjon av de antigenene og vise hvordan metoder varierer i utbytte. Metodikken present kan gjelde for en rekke forskjellige patogener, og kan oppnås ved å erstatte de antigener med immunogent structural proteiner av brukerens mikroorganismen av interesse. VLP og SVPs bistå med antigen karakterisering og utvalg av de beste vaksinekandidater.

Introduction

Viruslignende partikler (VLP) er en godkjent teknologi for humant vaksinasjon. Faktisk, noen av de mer moderne design lisensierte vaksiner, inkludert humant papillomavirus (HPV) og hepatitt Β (HepΒ) vaksiner benytter denne tilnærmingen. VLP-er dannet av strukturelle proteiner som er i stand til selv-sammenstillingen. De sammensatte partikler ligne virale morfologi, men kan ikke infisere eller reprodusere fordi de mangler virale genomer. VLP kan uttrykkes og renses fra en rekke prokaryote og eukaryote systemer. En gjennomgang av litteraturen viser at ulike uttrykks systemer er ansatt med følgende satser: bakterier – 28%, gjær – 20%, anlegg – 9%, insekt – 28%, og pattedyr – 15% ^en. Av notatet, er HPV-vaksiner basert på L1 kapsid protein som produseres i gjær (Gardasil) eller i et insekt celle system (Cervarix) ^2. HepΒ vaksiner, Recombivax og Engerix-Β, blir også produsert i gjær, og er sammensatt av HepΒ overflateantigen ³, 4.

Vi bruker pattedyr- og insektcelle-ekspresjonssystemer for å produsere VLP som krever ko-ekspresjon av flere strukturelle proteiner for montering. Vårt arbeid fokuserer på å designe, produsere og rensende VLP-baserte vaksiner mot menneskelige patogener: influensavirus, respiratorisk syncytialt virus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Våre metoder er fleksibel nok til å tillate ko-ekspresjon av de flere strukturelle proteiner fra multiple ekspresjonsplasmider, eller et enkelt ekspresjonsplasmid (figur 1). Tidligere har vi produsert og renset H5N1 VLP samlet fra co-uttrykk av plasmider som koder influensa hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), og matrise (M1) i humane embryonale nyre 293T celler ^5,6. Genene ble kodon-optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller og klonet inn i pTR600, en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholder cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig promotor, pluss intron A for å initiere transcription av eukaryote innsatser og bovint veksthormon polyadenylering signal for terminering av transkripsjon ^7. En lignende tilnærming ved hjelp av tre-plasmidet ko-ekspresjon av HA, NA (figur 1A) og en annen viral matriks-protein, HIV gag p55, ble benyttet for generering av human sesonginfluensa subtype H3N2 VLP i denne studien, og har vist seg å generere VLP av tilsvarende størrelse som influensa partikler ^8. Selv om influensavaksiner overveiende fremkalle anti-HA-antistoffer, tilsetning av influensa-neuraminidase formidler sialidase-aktivitet for å muliggjøre VLP spirende fra transfekterte celler ⁹ og også presentere ytterligere immunogene mål. For å fremstille RSV-VLP, vi også valgt urelaterte kjerne av HIV Gag å utforme prototypiske vaksiner som presenterer utelukkende RSV overflate glykoproteiner for å ytterligere demonstrere fleksibilitet av VLP i formasjonen ved hjelp av HIV gag, som tidligere beskrevet og karakterisert ved elektronmikroskopi ^6,10. andrehar tidligere vist at VLP presentere RSV-glykoproteiner kan settes sammen ved bruk av forskjellige virale komponenter fra Newcastle Disease Virus (NDV) ^11, og influensa matrise ^12. Full-lengde overflate-glykoprotein sekvenser ble anvendt i denne studien er å beholde innfødte konformasjoner som kan være nødvendige for funksjonell reseptor-binding og antistoffgjenkjenning assay ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA).

Våre eksempler på bruk av enkle plasmid ekspresjonssystemer å generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfelle av DENV, kan vi produsere subviral partikler (SVPs) uten kapsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid inneholdende et PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassett ^13. Uttrykket SVP brukes til å betegne mangelen på en kjerne eller kapsidprotein i monteringen av virale strukturelle proteiner. Chik VLP kan også produseres ved hjelp av et enkelt plasmid som inneholder et CHIKV strukturgenet kassett, koding kapsidbindende og konvolutt proteiner, eller jegnsect celler ved å infisere med et rekombinant baculovirus som koder for den samme strukturelle gen kassett som er optimalisert for insektcelle uttrykket (figur 1 B – C).

Sluttresultatet av uttrykket tilnærminger som er diskutert ovenfor er frigjøring av VLP inn i cellekulturmedium som kan deretter bli renset ved ultrasentrifugering gjennom en 20% glycerol pute. I denne rapporten presenterer vi metoder for å uttrykke og rense disse VLP fra pattedyr og insektcellesystemer.

Protocol

1. Pattedyr Expression System for generasjon av influensa H3N2 VLP Subklon viralt strukturelt glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og humant immunsviktvirus (HIV) Gag p55 inn i eukaryote ekspresjonsvektorer, slik som tidligere beskrevet pTR600. 7 Forsterke DNA i kjemisk kompetente Escherichia coli (f.eks DH5a) og isolere transfeksjon-grade plasmid ved hjelp av et plasmid rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Mengde DNA er avhengig av avkastning og b…

Representative Results

VLP rentene var variabel ved virusantigen konstruere design. I denne protokoll har vi demonstrert bruk av insekt og pattedyrceller for produksjon av SVP eller VLP i supernatanten og rensing ved hjelp av ultrasentrifugering. Fire undertyper av DENV PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassetter ble anvendt for å konstruere versjonene av DENV SVPs (avgrenset som 1-4) i tabell 1, og viser et område mellom 1,1 til 2,6 mg av totalt protein i 0,6 ml volumer. For VLP som krever e…

Discussion

Vi har brukt de teknikkene som er beskrevet ovenfor for å lykkes uttrykke og rense SVPs og VLP sammensatt av flere strukturelle proteiner av ulike patogener. Vanligvis bruker vi pattedyrekspresjonssystemer å generere våre VLP. Men i våre hender, pattedyr-celle avledet Chik VLP rentene var lave. Chik VLP utbyttet var mer robust når du bruker en rekombinant baculovirus-insektcellesystem. Generelt baculovirus-insektcellesystemer gir høyere mengder av rekombinante proteiner, noe som kan resultere fra de høyere cellet…

Materials

Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 mL)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096