Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em> Хеликобактерной</em> Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em> Кишечная палочка</em> В пакетном режиме
Summary
Высокий метод доходности для одностадийного отрицательной очистки рекомбинантного Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP) суперэкспрессированный в кишечной палочки с помощью диэтиламиноэтиловыми смол в пакетном режиме описана. HP-NAP очищают с помощью этого метода является полезным для разработки вакцин, лекарств, или для диагностики H. пилори -associated заболеваний.
Abstract
Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (НР-NAP) является одним из основных факторов вирулентности Helicobacter Pylori (H.). Он играет важную роль в H. пилори индуцированный воспаление желудка путем активации нескольких врожденных лейкоциты , включая нейтрофилы, моноциты, и тучных клеток. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства HP-NAP делают его потенциальной диагностики и вакцины кандидат на H. пилори и новый кандидат препарат для лечения рака. Для того чтобы получить значительные количества очищенного HP-NAP, используемой для его клинического применения, является эффективным способом, чтобы очистить этот белок с высоким выходом и чистотой должна быть установлена.
В этом протоколе, мы описали метод одностадийного отрицательной хроматографической очистки рекомбинантного HP-NAP избыточная экспрессия Escherichia coli (E.coli) с помощью диэтиламиноэтил (DEAE) ионообменной смолы (например., Колонки Sephadex) Iп пакетном режиме. Рекомбинантный НР-NAP составляет почти 70% от общего количества белка в E. палочка и почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0. При оптимальном состоянии при рН 8,0, большинство HP-NAP восстанавливается в несвязанной фракции в то время как эндогенные белки из E. палочка эффективно удаляются с помощью смолы.
Этот метод очистки с использованием отрицательной пакетном режиме хроматографии с DEAE ионообменных смол дает функциональную HP ворсом из E. палочки в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. Очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.
Introduction
Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах 1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по – прежнему высок 2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол 3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции.
Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) 4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения 5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека 7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т – хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака 8 и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций 9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов 11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом 12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка 13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.
Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP 14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы 17, иммуноглобулин G (IgG) , 18, гемоглобин 19, протеинфосфатазы 20, и фактор вирулентности флагеллином 21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено 22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен 23.
В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Отрицательный пакетный режим хроматографии с DEAE анионитов , представленные здесь подходит для очистки рекомбинантного HP-NAP сверхэкспрессируется в E палочки. Значения рН буферов , используемых на стадиях лизиса клеток и очистки очень важно для обеспечения растворимости HP-NAP в E. п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
References
- Brunette, G. W., et al. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).
- Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157 (2011).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection–the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
- Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
- de Bernard, M., D’Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?. Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
- Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
- Del Prete, ., G, , et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
- Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
- Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
- Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
- Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection–novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
- Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
- Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
- Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
- Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
- Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
- Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
- Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
- Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
- Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
- Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
- Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
- Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
- Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing ‘silent’ restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).
