Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge
Summary
Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.
Abstract
Die Dreistachliger Stichling Fisch hat sich als leistungsfähiges System entstanden, die genetische Basis einer Vielzahl von morphologischen, physiologischen und verhaltens Phänotypen zu untersuchen. Die bemerkenswert unterschiedlichen Phänotypen, die sich entwickelt haben als die Populationen im Meer zu unzähligen Süßwasser-Umgebungen anzupassen, kombiniert mit der Fähigkeit Meeres- und Süßwasserformen zu überqueren, bieten einen seltenen wirbel System, bei dem Genetik verwendet werden können genomische Regionen abzubilden Züge entwickelt steuern. Ausgezeichnete genomische Ressourcen sind ab sofort verfügbar, molekulargenetische Dissektion entwickelt Änderungen zu erleichtern. Während Kartierungsexperimente Listen interessante Kandidatengene erzeugen, sind funktionelle genetische Manipulationen erforderlich, um die Rolle dieser Gene zu testen. Die Genregulation können mit transgenen Reporter Plasmide und BACs integriert in das Genom untersucht werden, unter Verwendung des Tol2 Transposase-System. Funktionen von spezifischen Kandidatengene und cis – Aufsichtsrechtliche Elemente können durch Induktion gezielt beurteilt werdenMutationen mit TALEN und CRISPR / Cas9 Genome Editing Reagenzien. Alle Methoden erfordern Nukleinsäuren in befruchtete eine Zelle stickleback Embryonen Einführung machte eine Aufgabe, durch die dicke Chorion von stickleback Embryonen herausfordernd und die relativ kleinen und dünnen Blastomere. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Nukleinsäuren in stickleback Embryonen für transgene und Genombearbeitungsanwendungen beschrieben Genexpression und Funktion zu untersuchen, ebenso wie Techniken, um den Erfolg der Transgenese zu bewerten und stabile Linien wiederherzustellen.
Introduction
Ein wesentlicher Bestandteil der das Verständnis, wie die biologische Vielfalt entsteht, wird die genetischen und entwicklungs Basen entwickelt phänotypische Veränderungen in der Natur zu bestimmen. Die Dreistachliger Stichling Fisch, Gasterosteus aculeatus hat als hervorragendes Modell entstand für die genetische Grundlage der Evolution zu studieren. Stichlinge haben viele adaptive evolutionäre Veränderungen erfahren , wie Meeresfische unzählige Süßwasser – Umgebungen auf der ganzen nördlichen Hemisphäre besiedelt haben, in dramatischen morphologischen resultierenden, physiologische und Verhaltensänderungen 1. Den Genomen von Individuen 20-1 stickleback Populationen sequenziert und zusammengesetzt wurden und eine hohe Dichte Kopplungskarte erzeugt wurde , um die Baugruppe 2,3 noch weiter zu verbessern. Die genetische Kartierung Experimente haben genomischen Regionen identifiziert entwickelt Phänotypen zugrunde liegenden 4 – 6, und in einigen Fällen haben die funktionelle Rolle von spezifischen Kandidatengene wurden 7,8 getestet. Eine Reihe von Genomregionen morphologischen Veränderungen zugrunde liegen , wurden mit vielversprechenden Kandidaten – Gene identifiziert, aber diese Kandidaten noch nicht funktionell 9 getestet – 12. Darüber hinaus Stichlinge sind gemeinsame Modelle für Untersuchungen der Populationsgenetik / Genomik 13,14, Speziation 15, Verhalten 1, Endokrinologie 16, Ökotoxikologie 17, Immunologie und Parasitologie 18 19. Zukünftige Untersuchungen in jedem dieser Felder wird von der Fähigkeit profitieren funktionelle genetische Manipulationen in sticklebacks auszuführen. Neben ihrer kodierenden Sequenzen zu manipulieren, können die Rollen von Kandidatengenen durch das Studium ihrer cis – Aufsichtsrechtliche Sequenzen und funktionell steigend, fallend oder Eliminierung der Expression des Kandidatengens zu beurteilen. Mikroinjektions und Transgene Methoden in Stichlinge sind gut 7,8,20 etabliert und wurden ursprünglich entwickelt , unter Verwendung einer Meganuclease-vermittelte21 Verfahren zuerst in Medaka 22 beschrieben. Das modifizierte Mikroinjektions hier vorgestellten Verfahren ist gleichermaßen für Tol2-vermittelte Transgenese optimiert und vor kurzem Genome Editing Reagenzien einschließlich Talens und CRISPRs entwickelt.
Änderungen an cis Aufsichtsrechtliche Elemente sind gedacht , um morphologische Entwicklung kritisch zu sein, als cis Aufsichtsrechtliche Veränderungen 23 die negativen pleiotrope Auswirkungen von Codierungs Mutationen vermeiden. Aus diesem Grund hat die Prüfung und den Vergleich mutmaßliche cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen ein zentrales Ziel einer zunehmenden Zahl von Evolutionsstudien werden. Darüber hinaus sind die meisten Menschen eine Krankheit Varianten regulatorischen Varianten 24,25 und Modellwirbel Systeme sind sehr cis Aufsichtsrechtliche Element Funktion und Logik erforderlich , um zu studieren. Fische , die ihre Embryonen von außen in großer Zahl befruchten bieten leistungsstarke wirbel Systeme cis -Regelung zu studieren. Die Tol2 Transposon System, bei dem foreign DNA in das Genom integriert werden soll , wird flankiert von Tol2 Transposase Websites und Bindung koinjizierten mit Tol2 Transposase mRNA arbeitet, mit hoher Effizienz für die erfolgreiche Integration von Plasmid in Fisch – Genome – Konstrukte 26 – 28. Typischerweise wird ein potentieller Enhancer stromaufwärts von einem basalen Promotor kloniert (wie hsp70l 29) und fluoreszierendes Reportergens wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder mCherry in einem Tol2 Rückgrat und injizierte mit Transposase mRNA 26. Die Beobachtung der Expression des fluoreszierenden Reporter, entweder in injizierten Embryonen oder Nachkommen mit stabil integrierten Transgene, liefert Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression durch die vermeintliche Enhancer angetrieben. In weiteren Experimenten validiert Enhancer verwendet werden gewebespezifische Überexpression von Genen von Interesse zu fahren.
Für die Analyse von größeren cis Aufsichtsrechtliche Regionen, hochwertige Großeinsatz genomic Bibliotheken bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) verwendet haben 30 für beide Meeres- und Süßwasser Stichlinge gebaut. Diese BACs kann recombineered ein Gen mit einem fluoreszierenden Reporter – Gen in Zusammenhang mit einer großen (150-200 kb) genomischen Region 31 zu ersetzen. Die fluoreszierenden Reporter wird dann in einem Raum-Zeit-Muster ausgedrückt als durch regulatorische Sequenzen innerhalb des BAC bestimmt. Für Studien in Fisch kann Tol2 Sites zur BAC hinzugefügt werden 32,33 genomische Integration zu erleichtern. In späteren Stadien der Entwicklung , wenn in situ Hybridisierung technisch anspruchsvoll ist, kann die Fluoreszenz Auslesen des BAC verwendet werden , um Muster der Genexpression zu untersuchen, wie sie für stickleback Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) 20 gezeigt. Zusätzlich können fluoreszierende Expressionsmuster in einem Individuum über die Zeit verfolgt werden, die nicht mit in situ Hybridisierung durchgeführt werden. BACs auch eine additiona hinzuzufügen verwendet werdenl Kopie einer genomischen Region Dosierung eines Gens von Interesse zu erhöhen.
Zur Untersuchung der Genfunktion, Genom Bearbeitung ist eine explosionsartig expandierenden Bereich, der verwendet werden kann , gezielt Änderungen an genomische Sequenzen in einer Vielzahl von Organismen , 34 zu erzeugen. Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) sind modular aufgebaut, sequenzspezifische Nukleasen ursprünglich aus Pflanzenpathogene isoliert , die genau direkt zu einer genomischen Sequenz der Wahl zu binden , konstruiert werden können , und ein Doppelstrang 35,36 brechen erzeugen. Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS – Systeme wurden ursprünglich in Bakterien gefunden und eine Führung RNA verwenden und die Cas9 Protein eine Pause in einer Ziel – DNA – Sequenz , die komplementär zu der Führung 37 zu erzeugen. Die anschließende Reparatur des Doppelstrangbruchs beiden erstellt von TALENS und CRISPRs hinterlässt häufig eine kleine Insertion oder Deletion, die die Funktion der Zielsequenz stören können35-37. In Stichlinge wurden Talens verwendet Genexpression stören durch einen Verstärker 20 Targeting, und beide Talens und CRISPRs wurden in kodierenden Sequenzen (nicht veröffentlichte Daten) erfolgreich Mutationen erzeugt. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von CRISPRs für den Einsatz in Zebrabärbling als Richtlinie verwendet werden 38 CRISPRs für Stichlinge zu entwickeln.
Transgene und Genombearbeitungs Experimente erfordern Einführung von Nukleinsäuren in eine neu-Zellen embryo gedüngt. Durch Einführen des Transgens oder Genom-Bearbeitungswerkzeug früh in der Entwicklung, die Anzahl von genetisch manipulierten Tochterzellen im Embryo maximiert. Injizierten Embryonen werden dann visuell auf Fluoreszenz abgeschirmt oder molekular für Genom-Modifikationen durchmustert. Wenn Zellen zu der Keimbahn beitragen erfolgreich ausgerichtet sind, kann das Transgen oder Mutation werden, um eine Untergruppe von Nachkommen weitergegeben, auch wenn Nacheinspritzung Lethalität hoch ist. Die Mosaik-Fisch kreuzt werden kann, oderintercrossed und deren Nachkommen gesiebt, um die mutierten Allele oder ein stabil integriertes Transgen von Interesse zu erholen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für Transgene und Genom Bearbeitung von Reagenzien in einer Zell stickleback Embryonen und Überwachung für eine erfolgreiche genomischen Änderungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injizieren einer Zell stickleback Embryonen für die Transgenese oder Genom Bearbeitung präsentiert drei wichtigsten Herausforderungen. Zuerst in Bezug auf Genaktivität, die stickleback embryonalen Chorion ist hart und wird oft Nadeln brechen. Dieses Problem kann teilweise durch Verwendung dicker und stärker Glasmikropipetten und Einspritzen senkrecht zur Chorion (siehe Protokoll, 2) überwunden werden. dass so wenig Wasser wie möglich sichergestellt wird, zu den Embryonen hinzugefügt (gerade genug…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH R01 # DE021475 (CTM), ein NIH Predoctoral Ausbildungsbeihilfe 5T32GM007127 (PAE) und ein NSF Graduate Research Fellowship (NAE) gefördert. Wir danken Kevin Schwalbach für die Durchführung BAC Recombineering und Injektionen, Nick Donde zur Erzeugung von Sequenzierungsdaten CRISPR Sanger und Katherine Lipari für hilfreiche Rückmeldung über die Injektionsprotokoll.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
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