Dissection en Flat-montage van de driedoornige stekelbaars branchial Skeleton

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

Een ongelooflijke hoeveelheid diversiteit bestaat in het hoofd skelet onder de gewervelde dieren, vooral bij vissen. In veel gevallen faciliteert deze diversiteit verschillende voerstrategieën ^1-4, en kan grote veranderingen voor zowel externe als interne craniofaciale patronen te betrekken. De branchial skelet wordt intern in de keel van een vis en omringt de meeste van de mondholte. De branchial skelet bestaat uit 5 serie homologe segmenten, de voorste vier waarvan ondersteunen de kieuwen. Samen vormen deze vijf segmenten fungeren als een interface tussen vissen en hun eten ^5. Variatie in een veelheid van eigenschappen, waaronder kieuw rakers, keelholte tanden en botten branchial bijdragen aan efficiënte foerageren op verschillende soorten voedsel.

Stekelbaarsjes hebben een adaptieve radiatie na voorouderlijke oceanische vormen gekoloniseerd zoetwatermeren en kreken in het hele noordelijk halfrond ondergaan. De verschuiving in het dieetvan kleine zoöplankton in de oceaan om grotere prooi in zoet water heeft geleid tot een dramatische trofische variatie in verscheidene craniofaciale ⁶ trekken. Hoewel veel studies hebben zich gericht op externe craniofaciale verschillen in stekelbaars ^7-13, belangrijk craniofaciale veranderingen evolueren herhaaldelijk in de interne branchial skelet. De mogelijkheid om vruchtbare hybriden te creëren tussen morfologisch verschillende stekelbaars populatie biedt een uitstekende gelegenheid om de genetische basis van geëvolueerd wijzigingen in de branchial skelet in kaart.

Een trofische kenmerk van ecologische betekenis is de patroonvorming van kieuw Rakers, periodieke huid botten die de voorste en achterste vlakken van de branchial botten lijn en worden gebruikt om prooidieren te filteren. Vis die meestal voeden met kleine prooien hebben de neiging om langer en dichter afstand kieuw Rakers in vergelijking met vissen die zich voeden met grotere prooi ^14,15 te hebben. Variatie in kieuw rakers is gemeld zowel within en tussen soorten ^14-19, en aspecten van kieuw raker patroonvorming bijdragen aan trofische niches en fitness ^16. Decennia van onderzoek hebben uitvoerig gedocumenteerd kieuw asfaltwerker aantal en de lengte variatie in threespine stekelbaars ^17-21; Echter, deze studies meestal richten zich op de eerste rij van de kieuw Rakers. Recent onderzoek heeft aangetoond modulariteit in de genetische controle van de kieuw asfaltwerker nummer over de branchial skelet ^22,23 en over een enkele rij in kieuw asfaltwerker spatiëring ²³ en de lengte ²⁴ nadruk op het belang van het bestuderen van meer dan één rij of een enkele kieuw asfaltwerker naar het begrijpen ontwikkelingsstoornissen genetische basis van kieuw asfaltwerker reductie.

Een tweede trofische eigenschap van zowel de ecologische en biomedische betekenis is de patroonvorming van de keelholte tanden. Tanden bij vissen kan worden in zowel de orale kaak en de branchial skelet, bekend als faryngeale tanden. Orale tanden worden voornamelijk gebruikt voor prey vast te leggen terwijl de keelholte tanden worden gebruikt voor het kauwen en prooi manipulatie ^25-27. Beide sets vormen via gedeelde ontwikkelingsstoornissen mechanismen en zijn ontwikkelingsgebied homoloog ²⁸ beschouwd. Interessante modulariteit voordoet waarbij sommige soorten, zoals de zebravis, gebrek mondelinge en dorsale keelholte tanden ^29, terwijl andere soorten hebben meerdere getande ceratobranchials, pharyngobranchials, en soms basihyal getande en hypobranchials ^30. In stekelbaarsjes zijn keelholte tanden ventraal op de vijfde ceratobranchial en dorsaal op de voorste en achterste gevonden pharyngobranchials ^31. Kinematica op stekelbaars voeden tonen de orale kaak wordt voornamelijk gebruikt voor hun prooi vangen en te vergemakkelijken zuigvoeding ⁹ verlaten van het kauwen op de keelholte kaak. In cichliden, lagere keelkaak morfologie varieert enorm ^32,33 en is aangetoond dat adaptieve en gecorreleerd met trofische niche ³⁴ te zijn. Multiple zoetwater stekelbaars populaties dramatische toename in ventrale keelholte tand nummer ^23,35,36 geëvolueerd. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de ontwikkelingsstoornis genetische basis van deze geëvolueerd tand winst is grotendeels onderscheiden in twee onafhankelijk afgeleid populaties van zoetwater stekelbaarsjes ^36. In tegenstelling tot zoogdieren tanden, vis regenereren hun tanden continu tijdens het volwassen leven ^37. Beide eerder beschreven hoge getande zoetwater bevolkingsgroepen hebben een versneld tand replacement rate geëvolueerd, waardoor een zeldzame gewervelde systeem om de genetische basis van de regeneratie ³⁶ te bestuderen.

Een derde trofische eigenschap die herhaaldelijk in zoet water stekelbaars is geëvolueerd is langer epibranchial en ceratobranchial botten, de branchial boog gesegmenteerde homologen van de boven- en onderkaak, respectievelijk ^38. Langere branchial botten verlenen een grotere mondholte en waarschijnlijk zijn adaptieve voor het toestaan ​​van grotere prooien naar c te zijnonsumed. Bovendien in andere vissen, epibranchial botten zijn belangrijk voor depressie van de dorsale faryngeale tandplaten ^25. Net als kieuw Rakers en keelholte tanden, de branchial botten zijn interne en dus moeilijk om gemakkelijk te visualiseren en te kwantificeren.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te ontleden en een flatscreen-monteer de branchial skelet, zodat u gemakkelijk visualisatie en kwantificering van een aantal belangrijke craniofaciale eigenschappen. Hoewel dit protocol beschrijft een stekelbaars dissectie, dezelfde methode werkt op een verscheidenheid van andere vissen.

Protocol

Alle vis werk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of California-Berkeley (protocol nummer R330). Euthanasie werd uitgevoerd middels onderdompeling in 0,025% tricaïne-S gebufferd met 0,1% natriumbicarbonaat 39. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. 1. Voorbereiding Opmerking: Voer de stappen 1,1-1,5 in conische buizen of scintillatieflesjes die goed kunnen dichten en horizontaal gelegd. Vis hoeven niet voortdurend worden geschud, …

Representative Results

Dit protocol leidt tot een uitgesneden en vlak gemonteerd branchial skelet (figuur 4) waarbij een aantal verschillende belangrijke trofische eigenschappen kunnen worden gekwantificeerd. Vanuit een dorsale weergave kunt alle rijen van kieuw Rakers, alle keelholte tand platen, en bijna alle branchial beenderen gemakkelijk worden gevisualiseerd en gekwantificeerd 22 – 24,35,36,38,42. Alizarine rood fluoresceert ook een rhodamine en der…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10