이 비디오는 FACS 분리를 위해 밀도 구배로 흉선 상피 세포(TECH)를 강화하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 사용하여 TEC 응집체 형성을 촉진하는 것을 보여줍니다. EAK16-II/EAKIIH6 하이드로겔의 미세환경은 TEC의 생존과 기능을 유지하는 데 필요한 3D 구성을 제공합니다.
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방법 논문
EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을
이 논문에서
요약
초록
노화 또는 병리학적 모욕과 관련된 흉선 침범은 성숙한 T 세포의 생산량을 감소시킵니다. 기능이 저하된 흉선의 기능을 회복하는 것은 침입하는 병원체에 대해 효과적인 T 세포 매개 후천성 면역 반응을 유지하는 데 중요합니다. 그러나 흉선 재생과 활성화는 주로 흉선 상피 세포(TIC)의 생존과 기능에 중요한 흉선 기질의 고유한 3D 미세환경을 재현하는 데 어려움이 있기 때문에 어려운 것으로 판명되었습니다. 당사는 양친매성 EAK16-II 올리고펩타이드의 자체 조립 특성과 히스티딘화 유사체 EAKIIH6 기반으로 TEC 응집체의 형성을 촉진하기 위해 새로운 하이드로겔 시스템을 개발했습니다. TEC는 밀도 구배를 가진 분리된 흉선 세포에서 농축하고, 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 분류하고, 단백질 A/G 어댑터 복합체에 항-His IgG와 함께 고정된 항-상피 세포 접착 분자(EpCAM) 항체로 표지되었습니다. 세포 응집체의 형성은 TEC를 EAKIIH6 및 EAK16-II 올리고펩티드와 함께 배양한 다음 배지의 이온 농도를 증가시켜 겔화를 시작함으로써 촉진되었습니다. EAK 하이드로겔에 내장된 TEC 응집체는 흉선 누드 마우스에 이식할 때 생체 내에서 기능적 T 세포의 발달을 효과적으로 촉진할 수 있습니다.
서론
흉선이 획득 면역계의 기능에 필수적인 병원체 반응성 자기 저항성 T 세포의 다양한 집단의 생성을 담당 차 림프 기관이다. 그것은 흉선 기질의 스폰지 상 3 차원 (3-D) 매트릭스를 통해 이주 현상 흉선 세포는 림프구 전구 세포와 골수 이민 동적 인 기관이다 계통 명세서 및 분화를 거쳐, 최종적으로 이주 성숙한 T 세포. 이 아니라 프로그래밍 프로세스의 성공은 주로 이주 흉선 및 신청 흉선 상피 세포 (TEC는) 설정 및 흉선 미세 환경의 무결성을 유지하기위한 필수적인 가슴샘 기질의 주된 집단 간의 크로스 토크에 따라 다르다.
그 해부학 적 위치 및 고유 함수에 기초하여, TEC는 두 개의 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 피질의 열팽창 계수의 차이이다 respon (cTECs)자기 MHC (주요 조직 적합성 복합체)을 선택하기위한 sible은 T 세포 (긍정적 인 선택) 및 자기 반응성 T 세포 (음 선택) 1, 2를 제거하기위한 필수적인 수질의 열팽창 계수의 차이 (mTECs)을 제한. 많은 요인 (예를 들어, 노화, 감염, 방사선 조사, 약물 치료) 손상된 적응 면역의 결과로, 흉선 상피 세포에 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 수많은 시도에도 불구하고, 흉선 기능을 복원하기 때문에 흉선 ....
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프로토콜
실험에 사용 된 모든 동물은 앨 건강 네트워크 / 앨 가수 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토 및 승인 프로토콜에서 앨-가수 연구소에서 동물 시설에 수용되었다.
1. 콜라게나로 흉선 소화
- 수확 흉선 분비.
- 흉선을 수확 3-5 주령 C57BL6 / J의 이산화탄소에 마우스 (CO 2) 챔버를 안락사. 구체적으로, 3 ~ 5 분 동안 CO 2 유도에서 챔버에 마우스를 배치하고 심장 또는 호흡 정지를 확인하여 죽음을 확인합니다.
- 그 뒷면에있는 시체를 놓고 70 % 에탄올로 몸을 젖은. 피부를 통해 자사의 복부에 날카로운 직선 해부 가위로 작은 수평 절개를합니다. 이 밖에 내부에 켜져 있도록 양쪽 끝 (머리와 다리)에 피부를 당겨.
- 해부 가위 바로 아래에 수평 절단합니다가장 낮은 리브와 옆으로 다이어프램을 잘라. 겸자와 칼 모양의 과정을 잡고 양쪽에 최대 진행 리브의 중간을 잘라. 흉선은 명확하게 볼 수 있도록 갈비 / 흉골을 당깁니다.
참고 : 흉선은 직접 심장의 상단에 놓여 두 엽으로 구성되어 있으며 흰색 반투명 색이다. - 부드럽게 특종 및 결합 조직 및 세척 용액에 전송 오프 흉선 로....
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결과
CD45- 간질 세포를 풍부하게하는 밀도 구배 분리 프로토콜을 사용의 효과를 조사하기 위해, 인터페이스 석출 림프구 펠렛 모두에서 수확 한 세포를 항 CD45, 항는 EpCAM 항체로 염색 하였다. 두 방지 Ulex Europaeus 응집소 1 (UEA1) 및 안티 MHC 클래스 II 항체는 더 CTEC 및 mTEC 하위 집합을 식별하기 위해 염색 칵테일에 포함되었다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 일상적 TEC는 15-20 배 농축 가까이 달성 할 수 있었다.
EAK 하이드로 겔의 열팽창 계수의 차이의 집계를 검사하려면, 열팽창 계수의 차이는 보편적으로 막 바인딩, 적색 형광 tdTomato 분자를 표현하는 4 주 이전 B6.ROSA 만 T / MG 마우스에서 분리 하였다. 전술 한 바와 같이 제조 T.......
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토론
열팽창 계수의 차이가 흉선 기질의 주된 인구이며 흉선 샘의 구조와 기능에 필수적인 역할을하지만, 이들은 총 흉선 세포 수의 약 0.1 ~ 0.5 %를 차지한다. 그들은 또한 세포 사멸의 높은 비율이 때때로 즉, 치료는 세포 외 기질 (ECM)의 열팽창 계수의 차이를 해리, 콜라게나 제 소화 다음 관찰 깨지기 세포이다. 그들의 희귀 (~ 20 만 마우스의 흉선 당)과 취약성은 그것을 열팽창 계수의 차이를 분리하는 어려운 작업을했다. TEC 분리 고도로 정제 된 콜라겐 최근의 활용은 크게 효소 소화 15-19 다음 생균의 수를 증가하고있다.
항체 다량 세포 표면 라벨링 및 이벤트에 필요한 과도 번호 FACS에 의해 수집 될 필요가있다 그러나 열팽창 계수의 차이를 매우 작은 숫자들이 분석 및 분리를위한 중요한 과제로 남아. 항체 복합체 동안D 자기 비드 기술은 CD45 + 흉선 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다, 그들의 큰 수량이 장기적으로.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 R21 AI113000 (WSM)와 R01 AI123392 (YF)는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 부여 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| 그레이프 겸자, 스트레이트 | 파인 사이언스 툴 Inc. | 11053-10 | |
| Graefe 집게, 곡선 | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| 세척 용액 | 1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA | ||
| 1x PBS (인산염 완충 식염수) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (소 혈청 알부민) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) | Invitrogen | 15575-038 | |
| 소화 용액 | 9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM 연구 등급, 10 mM 헤페스, 0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM 연구 등급 | Roche | 05 401 127 001 | "정제된 콜라겐분해효소"라고 불립니다 |
| .1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | Corning | 430290 | |
| 60 mm 조직 배양 접시 | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 인슐린 주사기 28 1/2 G | Becton 디킨슨 | 329461 | |
| 5 ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 | 팔콘 | 352058 | |
| 5 ml 유리 피펫 | Fisher Healthcare | 13-678-27E | 흉선 조각을 헹구는 데 사용합니다. 흉선 조각은 플라스틱 피펫으로 벽에 달라 붙는 경향이 있습니다. |
| MACSmix 튜브 로테이터 | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 &마이크로; m 세포 여과기 | Falcon | 352360 | |
| 밀도 그라디언트 매체: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Cell Sorting | |||
| 5 ml 폴리프로필렌 라운드-바텀 튜브 | 팔콘 | 352063 | |
| 안티-마우스 CD16/CD32 (Fc 블록) | BD Biosciences | 553142 | 희석되지 않은 상태로 사용, 2 &마이크로; 샘플당 |
| l Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | 1:150, 10 &마이크로; 샘플당 |
| L Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | 1:100, 10 &마이크로; l 샘플 당 |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| 단일 세포 분석 소프트웨어 | FlowJo | ||
| EAK Gel Assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| 정제 안티 마우스 CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| 재조합 단백질 A/G | 피어스 바이오테크놀러지 | ||
| 1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | 는 "1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브" |
| 96-well, 조직 배양 플레이트, 저증발 뚜껑이 있는 둥근 바닥 | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking 플랫폼: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% 자당 | Sigma | S0389 | 멸균 증류수로 준비 |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company& 주의; | 맞춤형 합성, 10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | 미국 펩타이드 회사 | 맞춤형 합성, 7.5 mg/ml | |
| 완전한 중간 | , 10% FBS, 1% 펜/스트렙, 1% L-글루타민, 1% NEAA, 5 mM 헤페스, 50 &마이크로; M 2-메르캅토에탄올 | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | 사용 전 열 비활성화 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (비필수 아미노산) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-메르캅토에탄올(100개) | Millipore | ES-007-E | |
| 플랫폼 쉐이커: 벨리 댄서 | Stovall Life Sciences Inc. | 모델: USBDbo |
참고문헌
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insuli....
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재인쇄 및 허가
