En musmodell av retinal ischemi-reperfusion skada genom Elevation av det intraokulära trycket

Summary

Den här artikeln beskriver ett förfarande för att inducera retinal ischemi-reperfusionsskada av förhöjt intraokulärt tryck hos möss. Retinal ischemi-reperfusionsskada av förhöjt intraokulärt tryck tjänar till att modellera mänskliga sjukdomar som kännetecknas av nedsatt syre och näringstillförsel i näthinnan, som gör det möjligt för forskare att undersöka potentiella cellulära mekanismer och behandlingar för mänskliga sjukdomar i näthinnan neurovaskulära enheten.

Abstract

Retinal ischemi-reperfusion (I / R) är en patofysiologisk process som bidrar till cellskador i flera okulära tillstånd, inklusive glaukom, diabetesretinopati och retinal kärl ocklusioner. Gnagarmodeller av I / R skada tillhandahåller betydande insikt i mekanismer och behandlingsstrategier för människors I / R skada, särskilt när det gäller neurodegenerativa skador i näthinnan neurovaskulära enheten. Presenteras här är ett protokoll för att inducera retinal I / R skada i möss genom förhöjning av det intraokulära trycket (IOP). I detta protokoll, är ögats främre kammare med kanyl med en nål, genom vilken strömmar droppa av en förhöjd saltbehållare. Med hjälp av denna dropp för att höja IOP över systoliskt blodtryck, en utövare stannar tillfälligt inre retinal blodflöde (ischemi). När cirkulation åter (reperfusion) genom avlägsnande av kanylen, uppstår allvarliga cellskador, vilket resulterar i slutändan i retinal neurodegeneration. Senaste studtalet visar inflammation, vaskulär permeabilitet och kapillär degeneration som ytterligare delar av denna modell. Jämfört med alternativa näthinnan I / R metoder, såsom retinal artärligation, retinal I / R skada genom förhöjt lOP ger fördelar i sin anatomiska särdrag, experimentell spårbarhet och teknisk tillgänglighet, presenterar sig som ett värdefullt verktyg för att undersöka neuronal patogenes och behandling i näthinnans neurovaskulära enheten.

Introduction

Retinal ischemi-reperfusion (I / R) karaktäriserar många humana retinala patologier, inklusive glaukom, diabetesretinopati, och retinala vaskulära ocklusioner ^1. I näthinnan I / R, minskat blodflöde (ischemi) i näthinnan kärl skapar ett tillstånd av retinal överkänslighet mot syre och andra näringsämnen, utfällning svår oxidativa och inflammatoriska skador när cirkulationen därefter åter (reperfusion) ^2. Neurala näthinnan verkar särskilt utsatta för dessa förändringar, med retinal neurodegeneration är kanske den mest framträdande inslag i I / R-inducerad skada. Som presenteras här är ett protokoll för modellering retinal I / R skada i musen. Denna teknik gör det möjligt för forskare att undersöka potentiella mekanismer och behandlingsstrategier för mänskliga sjukdomar i näthinnan neurovaskulära enheten.

Uppfunnen 1952 av kirurger som försöker förstå de neurodegenerativa konsekvenserna av kirurgisk anemi ^3, Rodent retinal I / R av förhöjt intraokulärt tryck (lOP) reestablished i 1991 i syfte att standardisera neurodegenerativa endpoints efter ischemisk skada ^4. Använda droppa av en saltlösning reservoaren för att höja IOP över det systoliska blodtrycket, dessa studier visade att tryck okulär kanyle var tillräcklig för att upphäva retinal cirkulationen och därigenom initiera neuronal degeneration. Senare ansträngningar med hjälp av retinal I / R av förhöjt lOP har börjat utveckla mekanismerna bakom I / R-inducerad retinal neurodegeneration ^5-12. Flera grupper har rapporterat ytterligare patologiska förändringar, bland annat inflammation ^13,14, vaskulär permeabilitet ^15,16, och kapillär degeneration ^14,17. Sammantaget har dessa studier etablerat retinal I / R skada genom förhöjt lOP som en modell för retinal neurovaskulär sjukdom i allmänhet.

Karakterisera mekanismerna hos I / R skada är av avgörande betydelse för studiet av vascular sjukdom. Retinal I / R-skada genom förhöjt lOP är en av många hypoxi-inducerad skademodeller, även I / R-skador i lungan ^18, hjärta ^19, hjärna ^20, lever ^21, njure ²² och tarmen ^23. Dessa modeller har varit avgörande för att föra vår förståelse av vaskulär sjukdom och dess kliniska lösningar. Genom att utvidga utredningen av I / R processer till okulära vävnader, retinal I / R skada genom förhöjt lOP bidrar till att ge en mer heltäckande bild av dessa relaterade tillstånd.

Motsvarande tätt med kliniska neurodegenerativa tillstånd i näthinnan, retinal I / R skada genom förhöjt lOP ger ett värdefullt verktyg för forskare som är intresserade av att utforska ischemisk patogenes. Protokollet som beskrivs häri är riktad, foglig, och tillgängliga. Den kompletteras väl av endpoints i neuronal degenerering, såsom kvantifiering av näthinnans nervceller, mätning av retinal tjocklek, och elektrofysiologiska rInspelning av retinal neuronfunktion. Denna modell har visat sig användbar i att avancera neurovaskulära undersökning, och det visar löfte att tjäna status som en grundläggande protokoll i visuell medicinsk forskning.

Protocol

Etik uttalande: Alla förfaranden genomfördes i enlighet med de riktlinjer som anges av Johns Hopkins University Institutional Animal Care och användning kommittén. Notera: Möss som används under inspelningen är C57BL / 6-möss från Jackson, även om andra gnagare stammar eller arter kan också användas. Vid användning av andra stammar eller arter, vara medveten om att anestesi doser och skada tidslinje kan variera. Det är viktigt att anpassa I / R-förhållanden för att rymma sta…

Representative Results

De neurodegenerativa effekter av retinal I / R av förhöjt lOP vanligen utvärderas med hjälp av två standardmetoder. Neun immunomärkning av neuronala kärnor har visat betydande neuronal cellförlust efter I / R förolämpning (Figur 1). I korthet, ögon enukleation 7 dagar efter att jag / R fixerades i paraformaldehyd, märkt med den neuronala cellmarkör Neun, och hela monterade. Bilderna har tagits med konfokalmikroskopi, och celler märkta med Neun kvantifierade…

Discussion

Retinal I / R skada genom förhöjt lOP har visat sin användbarhet i modellering cellskador och dysfunktion, i synnerhet neurodegeneration, i gnagare retinal neurovaskulära enhet. Detta förfarande ger en robust kontrollvävnad och är lättillgängligt i form av teknisk förfining. Det har noterats i detta och andra I / R skademodeller som ökar trycket och varaktigheten av ischemi kan öka skadornas svårighetsgrad ^24. Av denna anledning har några utövare valt att använda ischemiska tryck och varaktigh…

Materials

Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1000 USP/mL
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 mL
SC-2kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/mL)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/mL)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30G1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1mL TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60mL Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X)	Invitrogen	10010-049	500 mL
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 mL
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/mL
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/mL)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/mL
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/mL
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579