IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Summary

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

Abstract

호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 - 림프구 항원을 주입함으로써 달성 - 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 - 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.

Introduction

호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 ^{1을 포함하는} 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 ^(2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 "프라이밍"된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 ^{3,4-되었다;} 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다.

최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 ^(5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 ^{-6,7- 감소.} 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션....

Protocol

모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

pIL1-을 DsRed 마우스 1. 표현형

참고 : 자손은 야생형 (WT) C57BL6 마우스를 이형 pIL1-을 DsRed 마우스 번식에 의해 생성됩니다. 세 주 네 오래된 새끼는 표현형에 대한 준비가 간주됩니다. 마우스의 턱밑 출혈은 약간의 수정 ⁽²³⁾ 설립 프로토콜을 따른다.

1. 마우스 새끼 전혈에서 백혈구의 분리
   1. 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 헤파린의 20 μl를 추가합니다.
   2. 케이지에서 한 강아지를 획득. 강아지의 식별 태그를 기록합니다. 턱밑 정맥에서 채혈 전에 새끼를 마취 할 필요가 없습니다.
   3. 목의 목덜미에 의해 강아지를 잡고 일에 턱밑 정맥을 관통5 밀리미터 란셋을 사용하여 전자 뺨 파우치. 혈액 방울 침투의 관점에서 스며 있도록 작은 구멍을 만들 충분한 힘을 적용합니다. 각각의 강아지에 대한 새 바늘을 사용합니다.
   4. 헤파린 함유 microcentrifuge 관에서 강아지 당 혈액의 5 방울 - 3를 수....

Results

pIL1-을 DsRed 마우스의 선별은 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈 백혈구에 의해 생산 된 표현형을 DsRed 형광 신호에 기초하여 수행된다. LPS 자극은 호중구, 단구, 수상 세포 및 ^26-28을 포함하여 골수 세포에서 IL-1β 생산을 유도하는 것으로 알려져있다. 따라서, 고립 된 백혈구 분석 유동 세포 계측법하기 전에 4 시간 동안 LPS와 함께 배양한다. 다음으로, 게이트는이 게이트 인구 측정 셀 사이즈 (FSC) 내부 복잡성 (SSC) (도 1A) ^29을 DsRed 및 신호에 기초하여 골수 세포를 순환 설정된다. pIL1-을 DsRed 마우스에서 같은 세포가 구별을 DsRed 신호 (그림 1B)를 표현하면서 WT 생쥐에서 순환 골수 세포는 최소한으로,을 DsRed을 표현한다. 표현형이 방법에 의해 확인 된 pIL1-을 DsRed 마우스 후속 실험에 사용된.......

Discussion

본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현미경 이미지. 이 세 가지 방법의 조합은 염증성 피부 병변에서 준비하는 호중구 (을 DsRed ⁺ / Ly6G ^+)의 운동성 활동의 시각화를 가능하게한다. 프라이머 작업 호중구의 이동 방향과 속도는 더 철새 경로 추적을 통해 정량화된다. 시간 경과 비디오 시리즈를 기록함으로써, 프라이밍 호중구 출현 실시간 동역학 I에 의해 염증성 사이트을 DsRed 발현 습득 모니터링ndividual 호중구는 혈관 외 공간에서 관찰된다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 과정이 성공적으로 여기.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
헤파린 나트륨	APP 제약	NDC 63323-540-31
ACK 용해 버퍼	Lonza	10-548E
태아 소 혈청	시그마 - 알드리치	F0926
리포 다당	시그마 - 알드리치	L4391
케타민 염산염	호스피라	NDC 0409-2051-05
자일라진	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
제모 크림	Church & 드와이트
아세톤	피셔 사이언티픽	A16P4
옥사졸론	시그마-알드리치	E0753
알렉사 플루어 647 안티 마우스 Ly6G 항체	BioLegend	127610
U-100 인슐린 주사기, 28G 바늘	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	시그마-알드리치	74817
버터플라이 주입 세트(27G 바늘)	BD	387312
FACS칼리버 세포분석기	BD
CellQuest Pro 소프트웨어	BD
컨포칼 현미경	Olympus	FV1000
Metamorph 소프트웨어	범용 이미징