Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом
Summary
Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.
Abstract
Зрелые соматические клетки могут быть отменены в плюрипотентные стволовые клетки, как состояние, используя определенный набор факторов перепрограммирования. Многочисленные исследования породили наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из различных типов соматических клеток с помощью трансдукции четыре Яманака факторы транскрипции: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc. Изучение ИПСК остается на переднем крае биологической и клинических исследований. В частности, иПСК конкретного пациента могут быть использованы в качестве новаторского инструмента для изучения патобиологии заболевания, так как иПСК может быть вызван из ткани любого индивидуума. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием, классифицируемых разрушением хряща и структуры кости в суставе. Синовиальной гиперплазии является одной из основных причин, или симптомы, которые приводят к этим результатам в РА. Фибробластоподобных синовиоциты (ФЛС) являются основным компонентом клетки в гиперплазированном синовии. ФЛС в суставе беспредельно размножаться, в конечном счете, вторжение в соседний cartilвозраст и кости. В настоящее время гиперпластический синовиальной можно удалить только с помощью хирургической процедуры. Удаленный синовиальной используется для исследований RA в качестве материала, который отражает воспалительное состояние сустава. В качестве основного игрока в патогенезе ревматоидного артрита, ФЛС может быть использован в качестве материала для создания и исследовать ИПСК пациентов с РА. В данном исследовании мы использовали FLSS пациента RA для создания иПСК. Использование лентивирусов системы, мы обнаружили, что ФЛС может генерировать RA конкретного пациента IPSC. В иПСК, полученные от ФЛС можно дополнительно использовать в качестве инструмента для изучения патофизиологии РА в будущем.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки платформа следующего поколения в различных клинических и биологических полей. Они являются многообещающим инструментом, который может быть использован при моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной медицинской терапии. Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) в основном были использованы для изучения и понимания плюрипотентных клеток. Тем не менее, изолированных разрушением человеческой бластоцисты, ЭСК связаны с несколькими этическими проблемами. В 2007 году доктор Яманака и его команда вспять процесс программирования клеток и разработал стволовые клетки из человеческой взрослых соматических клеток 1,2. Таким образом, в отличие от ЭСК, наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из зрелых соматических клеток, избегая этических препятствий.
Как правило, иПСК генерируются поставку четырех экзогенных генов: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Эти факторы Яманака первоначально доставлены с использованием лентивирусов и ретровирусных систем. Первые иПСК были получены из мышиного соматической Cгезов 3. Впоследствии, методика была применена к фибробластах дермы человека 1,2. Последующие исследования успешно создали иПСК из различных источников, таких как моча, кровь 4 5,6, кератиноциты 7, и несколько других типов клеток. Тем не менее, есть некоторые соматические клетки, которые не были использованы в перепрограммировании, а также скрининг возможностей перепрограммирования клеток разных типов от конкретных тканей в состоянии болезни, по-прежнему требуется.
Ревматоидный артрит (РА) является заболеванием, которое может поражать все суставы и привести к аутоиммунных состояний в других органах. РА поражает около 1% взрослых в развитых странах мира. Это довольно распространенное заболевание , и его частота возрастает с каждым годом 8. Тем не менее, RA трудно определить на ранних стадиях и oncebone разрушения происходит не существует лечения, которое может восстановить ущерб. Кроме того, эффективность лекарственного средства отличается от пациента к пациенту, и трудно предсказать, медикине, что требуется. Таким образом, разработка метода скрининга наркотиков необходим, и необходим материал клеток, которые могут отражать условия РА.
Фибробластоподобных синовиоцитов (FLSS) являются активным участником клеточное в патогенезе ревматоидного артрита 9,10. ФЛС существуют в синовиальной интимы прокладки между суставной капсулы и полости, которая также упоминается как синовии. Поддерживая совместную структуру и обеспечивая питательные вещества для окружающей хряща, ФЛС обычно играют решающую роль в совместной функции и техническом обслуживании. Тем не менее, ФЛС в РА имеют инвазивный фенотип. РА ФЛС есть рак , как фенотип, в конечном счете разрушает окружающую кость бесконечной пролиферации 10. С помощью этой уникальной характеристикой, ФЛС может быть использован в качестве перспективного материала, который может отражать патобиологии RA. Тем не менее, эти клетки редко производятся, так и клеточные фенотипы изменяют , так как клетки проходят через несколько проходов в ин витро </eм> условия. Таким образом, она может быть сложной, чтобы использовать RA FLSS в качестве инструмента, который может представлять состояние пациента.
Теоретически, RA пациента, полученных иПСК (RA-иПСК) может стать идеальным инструментом для скрининга лекарственных средств и проведения дальнейших исследований. Сформированные иПСК обладают способностью самообновления и может быть сохранена и расширена в пробирке. С плюрипотентности, эти клетки могут быть дифференцированы в зрелые хондроцитов и остеоцитов родах, которые могут способствовать клеточного материала для конкретных исследований в РА и других заболеваний , связанных с костями 11.
В данном исследовании мы покажем, как изолировать и расширить FLSS от удаленного хирургическим путем синовии, и как генерировать RA-ИПСК из ФЛС с использованием лентивирусов, содержащих Яманака факторы.
Protocol
Representative Results
Discussion
До открытия ИПСК, ученые в основном использовали эмбриональные для изучения биологии стволовых клеток и других клеточных клонов путем дифференциации. Тем не менее, стволовые клетки происходят из внутренней массы бластоцисты, которая является ранней стадии эмбриона. Для выделения ЭСК…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
