여기에서는 피더 세포없이 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 환자 유래의 섬유 아세포와 같은 활막에서 인간 - 유도 된 다 능성 줄기 세포를 생성하기위한 프로토콜을 기술한다.
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방법 논문
류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성
이 논문에서
요약
초록
성숙한 체세포 프로그래밍 요소의 정의 된 집합을 사용하여 다 능성 줄기 세포와 같은 상태로 되돌릴 수있다. 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 C-Myc와 : 많은 연구는 네 야마나카의 전사 인자를 형질 도입에 의해 다양한 체세포 유형의 유도-다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성했다. iPSCs 연구는 생물학 및 임상 연구의 최첨단에 남아있다. iPSCs 어떤 개인의 조직으로부터 유도 될 수 있기 때문에, 특히, 환자 별 iPSCs은 질병의 병리 생물학 연구 선구 도구로 사용될 수있다. 류마티스 관절염 (RA)은 관절 연골 및 뼈 구조의 파괴에 의해 분류 된 만성 염증성 질환이다. 활막 증식은 RA의 결과로 이어질 주요 원인이나 증상 중 하나입니다. 섬유 아세포 등 활막 (FLSS)가 증식 성 활막의 주성분 세포이다. 공동의 FLSS는 무제한 결국 인접 cartil 침입, 증식나이와 뼈. 현재, 과형성 활막은 수술에 의해 제거 될 수있다. 제거 된 활막은 관절의 염증 상태를 반영하는 재료로서 RA 연구에 사용된다. RA의 발병 기전에 중요한 플레이어, FLSS 생성하여 RA 환자의 iPSCs를 조사하는 재료로서 사용될 수있다. 본 연구에서는 iPSCs를 생성 RA 환자의 FLSS를 사용했다. 렌티 바이러스 시스템을 사용하여, 우리는 FLSS가 RA 환자 별 IPSC를 생성 할 수 있음을 발견했다. FLSS로부터 생성 iPSCs 더 앞으로 RA의 기전을 연구 도구로서 사용할 수있다.
서론
다 능성 줄기 세포는 다양한 임상과 생물 분야에서 차세대 플랫폼이다. 이들은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 회생 의학적 치료에 사용될 수있는 유망한 도구이다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)이 주로 연구 및 다 능성 세포를 이해하기 위해 사용되었다. 그러나, 인간 배반포의 파괴에 의해 분리, hESCs는 여러 윤리적 문제와 연관된다. 2007 년, 박사 신야 야마나카와 그의 팀은 셀 프로그래밍 과정을 역으로 인간 성인의 체세포 1,2에서 줄기 세포를 개발했다. 따라서 hESCs는 달리 유도 - 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)은 윤리적 장애물 회피, 성숙한 체세포에서 생성 될 수있다.
인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와 : 일반적으로, iPSCs는 네 개의 외래 유전자의 전달에 의해 생성됩니다. 이러한 야마나카 인자는 원래 렌티 바이러스 및 레트로 바이러스 시스템을 사용하여 제공됩니다. 첫 번째 iPSCs는 마우스 체세포의 C에서 파생 된ELL 학생 3. 그 후, 방법은 인간 피부 섬유 아세포 1,2- 적용 하였다. 후속 연구는 성공적 소변 -4- 피 5,6- 같은 다양한 소스로부터 생성 iPSCs 7....
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프로토콜
윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.
1. 활막 분리 및 확장
- 활막 격리
- 외과 위 두 쌍의 집게 한 쌍의 소독.
- 100mm의 접시에 활막 조직 전송와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)로 세척한다.
- 노란 지방 조직과 뼈 잔류 물을 잘라. 둘 베코의 변형 이글의 매체 20 % 태아 소 혈청 (DMEM) (FBS) 5 ㎖를 6 웰 플레이트의 웰에 트리밍 된 조직을 전송하고 추가 할 수 있습니다.
- 조각은 일회용 피펫을 관통 할만큼 작은 때까지 가위로 조직을 잘라.
- 50 ML 원뿔 튜브에 조직 함유 미디어를 전송합니다. 6 웰 플레이트에 20 % FBS와 DMEM 5 ㎖를 첨가하여 잔류 물질을 채취 한 후 튜브에 옮긴다.
- 얼음에 해동 콜라게나. 0.01 %의 최종 농도로 콜라게나 제를 첨가하고 파라 필름으로 튜브를 밀봉. 4 시간 동안 진탕하면서 37 ℃에서 수조에서 인큐베이션.
- 전량을 10 분 동안 300 × g으로 50 mL의 원심 분리, RT가 될 때까지 배양 한 후, 20 % FBS DMEM과 함께 튜브를 채....
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결과
본 연구에서 우리는 렌티 바이러스 시스템을 사용 FLSS로부터 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 기술한다.도 1a는 FLS 분리 프로토콜의 간단한 방식을 나타낸다. 활막 제거 수술 후, 조직은 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 잘게 하였다. 콜라겐 조직의 덩어리로부터 세포를 분리시켰다. 세포를 추가로 처리하기 전에 14 일간 배양 하였다.도 1b는 격리 FLSS의 형태를 나타낸다. 세포를 사용하기 전에 3 통로를 유지했다. FLSS는 일반 섬유 아 세포와 유사한 특성을 공유 할 수 있습니다. 우리의 격리 FLSS은 섬유 성 마커, 멘틴 및 피브로넥틴를 표명했다. 격리 RA FLSS는 또한 대 식세포 같은 활막 마커 CD68 (도 1C)의 낮은 발현을 보였다.
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토론
iPSCs의 발견 전에 과학자들은 주로 차별화를 통해 줄기 세포 생물학 및 다른 세포 계통을 연구하기는 ESC를 사용했다. 그러나,는 ESC는 초기 단계의 배아 인 배반포의 내부 매스에서 유래. 는 ESC를 분리하기 위해, 배반포의 파괴를 극복하기 불가능한 윤리적 문제를 제기 불가피하다. 는 ESC가 stemness와 다 능성 특성을 갖고 있지만, 또한, 이들은 개인으로부터 수득 될 수없고, 때로는 맞춤 분석 및 질병 검사를위한 이상적인 도구 아니다.
2007 년, 다카하시 등의 알. 인간 섬유 아세포 2에서 생성 된 iPSCs. 이론적으로는 ESC 달리 iPSCs 모든 성인 체세포에서 생성 될 수있다. 이러한 장점으로, iPSCs은 자동 세포 이식을위한 이상적인 도구가 될 것으로 생각된다. 또한, 후생 메모리의 개념, iPSCs 병원성 조건, 즉, 시뮬레이션을위한 이상적인 셀 재료로 생각되고. 질병 모델링. 혈액 세포, 소.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 질병관리센터(HI13D2188)가 지원하는 연구 프로그램의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm 접시 | TPP | 93100 | |
| 6웰 플레이트 | TPP | 92006 | |
| 50ml 코니컬 튜브 | SPL | 50050 | |
| 15ml 코니컬 튜브 | SPL | 50015 | |
| 10ml 일회용 피펫 | Falcon | 7551 | |
| 5ml 일회용 피펫 | Falcon | 7543 | |
| 12웰 플레이트 | TPP | 92012 | |
| FLS 절연 재료 | |||
| 수술용 가위 | |||
| 수술용 집게 | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Sigma Aldrich | P4333 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| 콜라겐분해 | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| 파라필름 | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM 비필수 아미노산 솔루션(100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-메르캅토에탄올 | 시그마 Aldrich | M3148 | |
| 폴리브레인 | 케미콘 | TR-1003-G | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Life Technologies | P4333 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 렌티바이러스 | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC 배지 성분 (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC 배지 성분 (Conc.: 543 μ g/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC 미디어 성분 (농도: 14ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC 매체 성분 (Conc.: 10.7 μ g/ml) |
| 기본 FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC 미디어 성분 (농도: 100ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC 배지 성분 (Conc.: 20 μ g/ml) |
| 인간 TGFβ 1 | Peprotech | 100-21 | iPSC 미디어 성분 (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC 미디어 성분 (Conc.: 64 μ g/ml) |
| 폴리브레네 | 케미콘 | TR-1003 | |
| 부티르산나트륨 | 시그마 알드리치 | B5887 | |
| 비트로넥틴 | 라이프 테크놀로지 | A14700 | |
| ROCK 억제제 | 시그마 알드리치 | Y0503 | |
| <강력한>내구성 조절 재료 | |||
| 18mm 커버 유리 | 슈페리어 | HSU-0111580 | |
| 4% 파라포름알디히드(PFA) | 기술 및 혁신 | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 항체 | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 항체 | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 항체 | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 항체 | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 항체 | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 항체 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 염소 anti-mouse IgG (H+L) 항체 | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체 | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, 코팅 | 현일 Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 클로로포름 | 시그마 알드리치 | 366919 | |
| 이소프리필알코올 | 밀리포어 | 109634 | |
| 에탄올 | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA 합성 키트 | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA 중합효소 | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE 버퍼 | Life Technologies | 15581-044 | |
| 로딩 스타 | Dyne Bio | A750 | |
| 아가로스 | 시그마-알드리치 | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA 래더 마커 | 효소 | DM003 | |
| 알칼리성 인산가수분해효소 | Millipore | SCR004 |
참고문헌
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131....
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재인쇄 및 허가
