Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung
Summary
Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Ein Protokoll vorgestellt zu sammeln und Permafrostkerne von Böden und Eis dekontaminieren. Die Abwesenheit von exogenen DNA-Kolonien und schlagen vor, dass Mikroorganismen detektiert das Material darstellen, anstatt Kontamination durch Bohren oder Verarbeitung.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
Die Kryosphäre (zB Permafrostböden, Eis Features, Gletscher Schnee, Firn und Eis) bietet einen Einblick in welche Arten von Organismen unter vergangener Umweltbedingungen bestehen blieb. Da diese Substrate Zehn- bis Hunderttausende von Jahren sein alt, ihre mikrobiellen Gemeinschaften, wenn da Ablagerung gefroren konserviert, reflektieren alten Umweltbedingungen. Um entsprechend dieser Ökosysteme zu analysieren und aussagekräftige biologische Informationen aus gefrorenen Böden und Eis, die richtige Erfassung und Verarbeitung der gefrorenen Proben extrahieren notwendig. Dies ist von größter Bedeutung , wie Klimaprognosen für das 21. Jahrhundert das Potenzial für eine deutliche Erwärmung in den arktischen und subarktischen Regionen zeigen 1. Insbesondere Interior Alaska und Grönland werden voraussichtlich bis zum Jahr 2100 2,3 etwa 5 ° C und 7 ° C, jeweils zu erwärmen. Dies wird voraussichtlich deutlich von Böden und Gewässern mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen und daher verwandtenbiogeochemische Prozesse. Die wärmeren Temperaturen und veränderte Niederschlagsregimes erwartet Permafrostdegradation in vielen Bereichen zu initiieren 2-5 potenziell zu einem dickeren, was saisonal aufgetaut (aktiv) -Schicht 6,7, das Auftauen von gefrorenen Böden und das Schmelzen von massiven Eiskörper wie Boden, Eis Keile und Segregation Eis 8. Dies würde dramatisch die biogeochemischen Attribute neben der Artenvielfalt von Pflanzen und Tieren in dieser Ökosysteme verändern.
Gletschereis und syngenetisch Permafrost Sediment und Eis Merkmale haben chemische und biologische Beweise für eine Umgebung gefangen darstellt, was zu der Zeit dort lebten die Merkmale gebildet. Zum Beispiel in Interior Alaska, beide Illinoisan und Wisconsin im Alter von Permafrost vorhanden sind und diese Permafrost insbesondere bietet einzigartige Orte von modernen Datierung bis 150.000 Jahre vor der Gegenwart (YBP), die biologische und geochemische Beweise für die impa enthaltenct vergangener Klimaveränderungen auf die Biodiversität. Als Ergebnis bieten diese Sedimente eine Aufzeichnung der Biogeochemie und Biodiversität über viele tausend Jahre. Da die Fläche niedrige Sedimentationsraten hat und wurde nie vergletschert, sind ungestörte Proben zugänglich für die Sammlung und Analyse, entweder Bohrungen vertikal in das Bodenprofil oder Bohren horizontal in Tunneln. Noch wichtiger ist , gibt es umfangreiche Datensätze , die vor allem in dieser Region 9-14 die einzigartigen biogeochemische Eigenschaften des Permafrosts hervorzuheben. Insbesondere ermöglicht die Anwendung der DNA-Analyse zur Schätzung Vorhandensein und das Ausmaß der biologischen Vielfalt in den beiden vorhandenen und alten Eis und Permafrost Proben Erforschung der Verknüpfung von alten Umweltbedingungen und Lebensraum der Besatzung durch bestimmte Organismen.
Frühere Studien haben klimatischen Auswirkungen auf Säugetiere, Pflanzen und Mikroorganismen aus Proben identifiziert 50k YBP Datierung 11, 15-19, obwohl jeder Studie eine differe verwendetnt Methodik zu sammeln und die Permafrost oder Eisbohrkernen dekontaminieren. In einigen Fällen wurden die Bohrkerne 16 sterilisiert, 20-21, obwohl die spezifische Methodik nicht geklärt werden, ob Fremd Nukleinsäuren auch von den Proben wurden eliminiert. In anderen Studien Isolate bakterielle 15 (beispielsweise Serratia marcescens) sowie fluoreszierenden Mikrokugeln 22 verwendet wurden , um die Wirksamkeit der Dekontaminationsverfahren zu messen.
Dieses Experiment war Teil einer größeren Studie mikrobieller Gemeinschaften aus Permafrostproben untersuchen zu etwa 40k YBP Jahrhundert. Das spezifische Ziel dieses Teils der Studie war erfolgreich Kerne Eis und Permafrost zu dekontaminieren. Unseres Wissens hat keine Methodik die Verwendung von Lösungen integriert entwickelt, um fremde Nukleinsäuren und die damit verbundenen Nukleasen aus dem äußeren Bereich der gefrorenen Kerne zu beseitigen. Dies ist trotz der Tatsache, dass diese Lösungen sind commonly verwendet Laborgeräte für die molekulare Experimente zu dekontaminieren.
Sobald die Kerne dekontaminiert wurden, wurde genomische DNA extrahiert , die entwickelten Protokolle von Griffiths et al. 23 und Töwe et al. 24, quantifiziert mit einem Spektralphotometer und verdünnt mit sterilen, DNA-freies Wasser 20 ng pro Reaktion zu erreichen. Bakterielle 16S – rRNA – Gene wurden mit den Primern 331f und 797R verstärkt und Sonde BacTaq 25 und Archaea – 16S – rRNA – Gene mit Primern Arch 349F und Arch 806R amplifiziert wurden und die Sonde TM Arch 516f 26 unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C für 600 sec , gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 25 sec mit abschließende Extension bei 40 ° C für 30 sec. Alle qPCR Reaktionen wurden doppelt durchgeführt. Die 20 & mgr; l Reaktionsvolumina enthalten 20 ng DNA, 10 & mgr; M Primer, 5 & mgr; M der Sonde, und 10 ul der qPCR Reaktionsmischung. Standards for Bakterien und Archaea qPCR wurden unter Verwendung von genomischer DNA , die aus Pseudomonas und Halobacterium salinarum fluorescens, respectively. Beide waren gewachsen Phase zu protokollieren. Plattenzählungen wurden durchgeführt, und die DNA wurde aus den Kulturen isoliert. Genomische DNA wurde mit einem Spektrophotometer unter der Annahme von einem und sechs Kopien des 16S rRNA – Gens pro Genom für H. quantifiziert salinarum und P. fluorescens bzw. 27-28. Kopieren Nummern der Bakterien und Archaea Gene auf der Basis der Standardkurve berechnet wurden, log-transformierten für ungleiche Varianzen zwischen den Behandlungen zu berücksichtigen und durch ANOVA bewertet.
Gemeinschafts Zusammensetzung wurde durch Sequenzierung des 16S – rRNA – Gen unter Verwendung von Flusszellen und Brückenverstärkertechnologie und Analyse der Gemeinden mit "quantitative Einblicke in die mikrobielle Ökologie" (QIIME) 29 bestimmt. Vorwärts und rückwärts liest zusammen wurden zusammengefügt und dann wurden Sequenzen gefiltert, indiziert,und qualitativ hochwertige Vertreter wurden für die de novo operativen taxonomischen Einheiten (OTU) Zuordnung durch Sequenzabgleich mit einer Referenzdatenbank ausgewählt. Aligned Sequenzen wurden für taxonomische Zuordnung zu einer separaten Referenzdatenbank verglichen. Ein phylum Ebene OTU Tabelle wurde erstellt allgemeine Gemeinschaft Zusammensetzung zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Obwohl die zurückgewonnene Taxa die komplette historische Gemeinde nicht darstellen können, aus der Analyse von Gletschereis und Permafrostproben gewonnen diejenigen können 15-16 wertvolle historische Informationen über ausgewählte Zeiträume ergeben. So hat beispielsweise sinnvolle biologische Informationen wurden aus Eis Studien zur Untersuchung der anaeroben Aktivität in grönländisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
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