הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח
Summary
הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. פרוטוקול מוצג לאסוף לטהר ליבות קרח העד של קרקעות וקרח. עדר מושבות אקסוגניים ו- DNA מראה כי מיקרואורגניזמים זוהה מייצג את החומר, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
הקריוספירה (למשל, קרקעות קפוא, תכונות קרח, שלג קרחונים, firn, וקרח) מציעה צצה אל מה סוגים של אורגניזמים התעקש בתנאים סביבתיים בעבר. מאז מצעים אלה יכולים להיות עשרות עד מאה אלף שנים, קהילות החיידקים שלהם, כאשר נשמרו קפוא מאז בתצהיר, משקף תנאים סביבתיים עתיקים. כדי לנתח אלה מערכות אקולוגיות כראוי ולחלץ מידע ביולוגי משמעותי מקרקעות קפוא וקרח, אוסף ועיבוד תקין של הדגימות הקפואות יש צורך. זה הוא בעל חשיבות עליונה כמו תחזיות אקלים עבור המאה ה -21 מצביעות על פוטנציאל התחממות בולטת הארקטי ותת-הארקטי אזורי 1. באופן ספציפי, הפנים אלסקה וגרינלנד צפויים לחמם כ 5 מעלות צלזיוס ו -7 ° C, בהתאמה עד שנת 2100 2,3. זה צפוי להשפיע על הקרקע באופן משמעותי וקהילות חיידקים ימיים, ולכן, הקשוריםתהליכי biogeochemical. הטמפרטורות החמות המשטר משקע שינה צפויים ליזום שפלת permafrost בתחומים רבים 2-5 פוטנציאלי מוביל מופשר עבה, עונתיות (פעיל) שכבת 6,7, הפשרת קרקעות קפוא, ואת ההיתוך של גופי קרח מסיביים כגון קרקע קרח, טריזי קרח, והפרדת קרח 8. זה היה משנה את תכונות biogeochemical דרמטי בנוסף המגוון הביולוגי של צמחים ובעלי חיים במערכות אקולוגיות אלה.
קרח קרחונים ותכונות permafrost משקעים וקרח syngenetic יש לכודים כימיים ממצא ביולוגי של סביבה המייצגים מה שחי שם בזמן התכונות נוצרו. לדוגמה, ב הפנים אלסקה, הן Illinoisan וויסקונסין בגילאי permafrost קיימים permafrost זה בפרט מספק מיקומים ייחודיים משנת מודרני 150,000 שנים לפני ההווה (שנה לפני זמננו) המכילים ראיות ביולוגיות גיאוכימיים של הרשות למניעת הלבנתct של שינויים אקלימיים בעבר על המגוון הביולוגי. כתוצאה מכך, משקעים אלה מספקים תיעוד של biogeochemistry והמגוון הביולוגי על אלפים רבים של שנים. מאחר שהתחום יש שיעורי שקיעה נמוכים, ומעולם לא מכוסה קרחונים, דגימות באין מפריע נגישות עבור איסוף וניתוח, או קידוח אנכי לתוך אדמת הפרופיל או הקידוח אופקי במנהרות. יתרה מכך, רשומות נרחב קיימים במיוחד להדגיש את המאפיינים הייחודיים של biogeochemical permafrost באזור זה 9-14. באופן ספציפי, היישום של ניתוח דנ"א להעריך נוכחות והיקף של מגוון ביולוגי הוא דגימות קרח קפוא קיימות ועתיקות מאפשר חקירה של ההצמדה של תנאים סביבתיים העתיקו ובית הגידול לכיבוש על ידי אורגניזמים ספציפיים.
מחקרים קודמים זיהו השפעות אקלימיות על יונקים, צמחים ומיקרואורגניזמים ממדגמים המתוארכים 50k 11 שנה לפני זמננו, 15-19, למרות כל המחקר השתמש differeהמתודולוגיה NT לאסוף לטהר ליבות קרח העד או קרח. בחלק ממקרים, ליבות הקידוח עוקרו 16, 20-21, על פי מתודולוגיה ספציפית לא הבהירה אם חומצות גרעין זרות גם הודחו מן הדגימות. במחקרים אחרים, חיידקים מבודדים 15 (למשל, marcescens Serratia) וכן microspheres פלורסנט 22 שמשו כדי למדוד את היעילות של שיטות ניקוי מתאימות.
ניסוי זה היה חלק ממחקר גדול חוקרת קהילות חיידקים מדגימות permafrost שראשיתה כ 40k שנה לפני זמננו. המטרה הספציפית של חלק זה של המחקר הייתה לטהר בהצלחת ליבות קרח קפוא. למיטב ידיעתנו, אין מתודולוגיה שילבה את השימוש של פתרונות שנועדו לחסל חומצות גרעין זרים nucleases הקשורים מהחלק החיצוני של ליבות קפוא. זאת למרות העובדה שפתרונות אלו הם commonly לשמש כדי לטהר ציוד מעבדה לניסויים מולקולריים.
לאחר ליבות היו לעקרם, הדנ"א הגנומי הופק באמצעות פרוטוקולים שפותחו על ידי גריפיתס et al. 23 ו towe et al. 24, לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר, ומדולל עם מים סטריליים, חינם-DNA כדי להשיג 20 ng לכל תגובה. גנים rRNA 16S בקטריאלי היו מוגבר עם פריימרים 331F ו 797R ו לחקור BacTaq 25 וגנים archaeal 16S rRNA היו מוגבר עם פריימרים קשת 349F ואדר 806R ו לחקור TM קשת 516F 26 בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 600 שניות ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 57 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות עם סיומת סופית ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. כל התגובות qPCR נערכו בשני עותקים. 20 כרכי התגובה μl כללו 20 DNA ng, 10 מיקרומטר של פריימרים, 5 מיקרומטר של החללית, ו -10 μl של תערובת תגובת qPCR. תקני FOr חיידקים archaeal qPCR אלה נערכו על בסיס ה- DNA הגנומי של Pseudomonas fluorescens ו Halobacterium salinarum, בהתאמה. שניהם גדלו להתחבר שלב. ספירת צלחת נערכה ו- DNA שבודד התרבויות. הדנ"א הגנומי היה לכמת עם ספקטרופוטומטר עם ההנחה של אחד ושישה עותקים של הגן 16S rRNA לכל הגנום עבור H. salinarum ו פ fluorescens, בהתאמה 27-28. מספרי העתק של גני חיידקיים archaeal חושבו בהתבסס על עקומת הסטנדרט, יומן טרנספורמציה על מנת להתייחס להבדלים שוויוניים בין הטיפולים, הוערך על ידי ANOVA.
רכב הקהילה נקבע על ידי רצף גן 16S rRNA באמצעות תאי זרימה וטכנולוגיות הגברת גשר וניתוח הקהילות עם "תובנה כמוני לתוך אקולוגיה מיקרוביאלית '(QIIME) 29. קדימה לאחור קורא חוברו יחדיו ואז רצפים סוננו, באינדקס,ונציגים באיכות גבוהות נבחרו יחידות טקסונומיות דה נובו מבצעיות (OTU) הקצאה באמצעות יישור רצף עם נתונים להפניה. רצפים מסודרים הושוו מסד נתוני התייחסות נפרד למשימת טקסונומיות. שולחן OTU מערכה רמת נוצרה כדי לקבוע את הרכב הקהילה בכלל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. למרות המינים התאוששו עלולים שלא לייצג את הקהילה ההסטורית המלאה, אלה התאוששו מניתוח דגימות קרח קפוא קרחונים יכולים להניב מידע היסטורי רב ערך על פרקי זמן בוחרים 15-16. למשל, מידע ביולוגי משמעותי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
