जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से Exogenous सामग्री को हटाने प्राचीन जैविक समुदायों शरण के अंदर जांच करने के लिए
Summary
cryosphere संरक्षित जीवों कि पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम करने के लिए पहुँच प्रदान करता है। एक प्रोटोकॉल को इकट्ठा करने और मिट्टी और बर्फ के permafrost कोर शुद्ध करना प्रस्तुत किया है। बहिर्जात कालोनियों और डीएनए के अभाव का सुझाव है कि पता लगाया सूक्ष्मजीवों सामग्री के बजाय, ड्रिलिंग या प्रसंस्करण से संदूषण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
Cryosphere (जैसे, permafrost मिट्टी, बर्फ सुविधाओं, हिमनदों बर्फ, Firn, और बर्फ) किस प्रकार के जीवों के पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम में एक झलक प्रदान करता है। इन substrates हजारों वर्ष पुरानी है, उनकी सूक्ष्म समुदायों, जब जमाव के बाद से जमे हुए संरक्षित के सैकड़ों करने के लिए दसियों हो सकता है के बाद से, प्राचीन पर्यावरण की स्थिति को दर्शाते हैं। उचित रूप से इन पारिस्थितिक तंत्र का विश्लेषण और जमे हुए मिट्टी और बर्फ, उचित संग्रह और प्रसंस्करण जमे हुए नमूनों की सार्थक से जैविक जानकारी निकालने के लिए आवश्यक है। यह अत्यंत महत्व का है के रूप में 21 वीं सदी के लिए जलवायु अनुमानों आर्कटिक और उप-आर्कटिक क्षेत्रों 1 में एक स्पष्ट वार्मिंग के लिए संभावित संकेत मिलता है। विशेष रूप से, आंतरिक अलास्का और ग्रीनलैंड गर्म करने के लिए लगभग 5 डिग्री सेल्सियस और 7 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः 2100 2,3 से उम्मीद कर रहे हैं। यह काफी मिट्टी और जलीय सूक्ष्म समुदायों, और इसलिए, संबंधित को प्रभावित करने की उम्मीद हैbiogeochemical प्रक्रियाओं। गर्म तापमान और वर्षा बदल शासन कई क्षेत्रों में 2-5 permafrost गिरावट संभवतः एक मोटा, मौसम thawed (सक्रिय) के लिए अग्रणी परत 6.7, जमे हुए मिट्टी के विगलन, और जैसे बड़े पैमाने पर बर्फ पिघलने के शव का आरंभ करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं जमीन बर्फ, बर्फ wedges, और अलगाव बर्फ 8। यह नाटकीय रूप से पौधों और इन पारिस्थितिक तंत्र में जानवरों की जैव विविधता के अलावा biogeochemical गुण बदल जाएगा।
हिमनदों बर्फ और syngenetic permafrost तलछट और बर्फ सुविधाओं रासायनिक और एक वातावरण का प्रतिनिधित्व क्या समय सुविधाओं का गठन पर वहाँ रहते थे की जैविक सबूत फंस चुके हैं। उदाहरण के लिए, आंतरिक अलास्का में, दोनों Illinoisan और विस्कॉन्सिन आयु वर्ग के permafrost कर रहे हैं वर्तमान और विशेष रूप से इस permafrost वर्तमान (YBP) कि Impa के जैविक और geochemical सबूत होते हैं पहले 150.000 साल के लिए आधुनिक से डेटिंग अद्वितीय स्थानों प्रदान करता हैजैव विविधता पर पिछले जलवायु परिवर्तन की सीटी। नतीजतन, इन अवसादों कई वर्षों के हजारों के ऊपर biogeochemistry और जैव विविधता का एक रिकॉर्ड प्रदान करते हैं। के बाद से क्षेत्र में कम अवसादन दर है और हिमाच्छादित कभी नहीं किया है, अबाधित नमूने खड़ी मिट्टी प्रोफ़ाइल या ड्रिलिंग क्षैतिज सुरंगों में में संग्रह और विश्लेषण, या तो ड्रिलिंग के लिए पहुंच रहे हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, व्यापक रिकॉर्ड मौजूद है कि विशेष रूप से इस क्षेत्र में 9-14 permafrost की अनूठी biogeochemical सुविधाओं पर प्रकाश डाला। विशेष रूप से, डीएनए विश्लेषण के आवेदन दोनों वर्तमान और प्राचीन बर्फ और permafrost नमूनों में उपस्थिति और जैव विविधता की हद तक अनुमान लगाने के लिए विशिष्ट जीवों द्वारा कब्जे के लिए प्राचीन पर्यावरण की स्थिति के संबंध और वास के अन्वेषण के लिए सक्षम बनाता है।
पिछले अध्ययनों स्तनधारियों, पौधों और 50 के लिए डेटिंग YBP 11, 15-19 नमूनों से सूक्ष्मजीवों पर जलवायु प्रभावों की पहचान की है, हालांकि प्रत्येक अध्ययन एक विभिन्न इस्तेमाल कियाNT कार्यप्रणाली को इकट्ठा करने और permafrost या आइस कोर शुद्ध करना। कुछ उदाहरणों में, ड्रिलिंग कोर 16, 20-21 निष्फल रहे थे, हालांकि विशिष्ट पद्धति स्पष्ट नहीं किया विदेशी न्यूक्लिक एसिड भी नमूने से सफाया कर दिया गया है। अन्य अध्ययनों में, बैक्टीरियल 15 (जैसे, Serratia marcescens) के साथ ही फ्लोरोसेंट microspheres 22 परिशोधन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है आइसोलेट्स।
इस प्रयोग से वापस लगभग 40k YBP के लिए डेटिंग permafrost नमूनों से माइक्रोबियल समुदायों की जांच के लिए एक बड़ा अध्ययन का हिस्सा था। अध्ययन के इस भाग के विशिष्ट उद्देश्य को सफलतापूर्वक बर्फ और permafrost कोर शुद्ध करना था। हमारे ज्ञान करने के लिए, कोई कार्यप्रणाली जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से विदेशी न्यूक्लिक एसिड और जुड़े न्युक्लिअसिज़ समाप्त करने के लिए डिजाइन समाधान के उपयोग के एकीकृत किया गया है। यह सच है कि इन समाधान commonl हैं के बावजूद हैY आणविक प्रयोगों के लिए प्रयोगशाला के उपकरण शुद्ध करता था।
एक बार जब कोर decontaminated थे, जीनोमिक डीएनए प्रोटोकॉल ग्रीफिथ एट अल। 23 और Towe एट अल। 24 द्वारा विकसित का उपयोग कर निकाला गया था, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मात्रा, और बाँझ, डीएनए मुक्त पानी से पतला प्रतिक्रिया प्रति 20 एनजी प्राप्त करने के लिए। बैक्टीरियल -16 rRNA जीन प्राइमरों 331F और 797R के साथ प्रवर्धित थे और BacTaq 25 और अर्चेअल -16 जांच rRNA जीन प्राइमरों आर्क 349F और आर्क 806R और निम्न शर्तों के तहत टीएम आर्क 516F 26 जांच के साथ परिलक्षित गया: 600 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 45 चक्रों के बाद 30 सेकंड, 60 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री 30 सेकंड के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार के साथ 25 सेकंड के लिए सी के लिए 95 डिग्री सेल्सियस की। सभी qPCR प्रतिक्रियाओं दो प्रतियों में आयोजित की गई। 20 μl प्रतिक्रिया की मात्रा 20 एनजी डीएनए, प्राइमरों के 10 माइक्रोन, जांच के 5 सुक्ष्ममापी, और qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl शामिल थे। मानक के लिएr बैक्टीरियल और अर्चेअल qPCR जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर तैयार कर रहे थे स्यूडोमोनास fluorescens और Halobacterium salinarum, क्रमशः। दोनों चरण लॉग इन करने के बड़े हो रहे थे। प्लेट मायने रखता आयोजित की गई और डीएनए संस्कृतियों से अलग किया गया था। जीनोमिक डीएनए एक की धारणा और एच के लिए जीनोम प्रति -16 rRNA जीन के छह प्रतियों के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ मात्रा निर्धारित की गई थी salinarum और पी fluorescens क्रमश: 27-28। बैक्टीरियल और अर्चेअल जीन की प्रतिलिपि संख्या मानक वक्र के आधार पर गणना की गई है, उपचार के बीच असमान प्रसरण के लिए खाते में करने के लिए लॉग-बदल, और एनोवा द्वारा मूल्यांकन।
सामुदायिक संरचना -16 rRNA जीन अनुक्रमण प्रवाह कोशिकाओं और पुल प्रवर्धन तकनीकों का प्रयोग और 'माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि' (QIIME), 29 के साथ समुदायों का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था। आगे और रिवर्स पढ़ता साथ शामिल हो गए थे और फिर दृश्य थे फ़िल्टर, अनुक्रमित,और उच्च गुणवत्ता के प्रतिनिधियों नए सिरे से परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (OTU) एक संदर्भ डेटाबेस के साथ अनुक्रम संरेखण के माध्यम से काम के लिए चयन किया गया था। गठबंधन दृश्यों वर्गीकरण काम के लिए एक अलग संदर्भ डेटाबेस की तुलना में थे। एक जाति के स्तर OTU तालिका सामान्य समुदाय संरचना का निर्धारण करने के लिए बनाया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
cryosphere संरक्षित जीवों कि पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम करने के लिए पहुँच प्रदान करता है। हालांकि बरामद taxa पूरा ऐतिहासिक समुदाय का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, बर्फ बर्फ और permafrost नमूनों के विश्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
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