Fjerning av eksogene materialer fra den ytre delen av frosne kjerner for å undersøke den gamle biologiske samfunn skjult Inside

Summary

Kryosfæren tilbyr tilgang til bevarte organismer som vedvarte etter siste miljøforhold. En protokoll er presentert for å samle og rense permafrost kjerner av jord og is. Fraværet av eksogene DNA-kolonier og antyder at mikroorganismer som detekteres representerer materialet i stedet for forurensning fra boring eller foredling.

Abstract

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

Introduction

Kryosfæren (f.eks permafrost jord, is funksjoner, glacial snø, firn og is) gir et innblikk i hva slags organismer vedvarte etter siste miljøforhold. Siden disse underlag kan være titalls til flere hundre tusen år gamle, deres mikrobielle samfunn, når bevarte frosset siden deponering, reflektere gamle miljøforhold. For å riktig analysere disse økosystemene og trekke ut menings biologisk informasjon fra frossen jord og is, forsvarlig innsamling og behandling av de frosne prøvene er nødvendig. Dette er av største betydning som klima anslag for det ^21. århundre indikerer potensialet for en markant oppvarming i Arktis og sub-arktiske strøk ^1. Spesielt interiør Alaska og Grønland er forventet å varme ca 5 ° C og 7 ° C, henholdsvis 2100 ^2,3. Dette forventes å ha betydelig innvirkning jord og vannlevende mikrobielle samfunn, og derfor relatertbiogeokjemiske prosesser. Jo varmere temperaturer og endrede nedbørsregime er forventet å starte permafrost nedbrytning i mange områder ^2-5 potensielt kan føre til en tykkere, sesong tint (aktiv) lag ^6,7, tining av frosne jord, og smeltingen av massive isen organer som bakken is, iskiler, og segregering is ^8. Dette vil dramatisk endre biogeokjemiske egenskaper i tillegg til det biologiske mangfoldet av planter og dyr i disse økosystemene.

Breis og syngenetic permafrost sediment og is egenskaper har fanget kjemiske og biologiske bevis for et miljø som representerer hva bodde der på den tiden funksjonene dannet. For eksempel, i Interior Alaska, både Illinoisan og Wisconsin i alderen permafrost er til stede, og dette permafrost i bestemte gir unike steder som daterer seg fra moderne til 150.000 år før nåtid (YBP) som inneholder biologiske og geokjemiske bevis for impact av tidligere klimaendringer på biologisk mangfold. Som et resultat av disse sedimentene gi en oversikt over den biogeokjemi og biologisk mangfold gjennom mange tusen år. Siden området har lav sedimentasjonsratene og har aldri vært isbreer, uforstyrrede prøver er tilgjengelige for innsamling og analyse, enten boring vertikalt i jordsmonnet eller boring horisontalt i tunneler. Enda viktigere, omfattende poster finnes som spesielt fremheve de unike biogeokjemiske funksjoner i permafrosten i denne regionen ^9-14. Spesielt til bruk av DNA-analyse anslår tilstedeværelse og omfang av biologisk mangfold i både nålevende og gamle isen og permafrostprøver gjør utforskning av sammenhengen av gamle miljøforhold og habitat til okkupasjon av bestemte organismer.

Tidligere studier har identifisert klimatiske virkninger på pattedyr, planter og mikroorganismer fra prøver datert til 50k YBP ^{11, 15-19,} selv om hver studie brukte en different metode for å samle og rense permafrosten eller iskjerner. I noen tilfeller ble borkjerner sterilisert ^{16, 20-21,} skjønt den spesifikke metoden ikke avklare om fremmede nukleinsyrer ble også fjernet fra prøvene. I andre studier, isolerer bakterie ¹⁵ (f.eks, Serratia marcescens) samt fluorescerende mikrosfærer ²² har blitt brukt for å måle effekten av dekontaminering prosedyrer.

Dette eksperimentet var en del av en større studie som undersøkte bakteriesamfunn fra permafrostprøver dateres tilbake til ca 40k YBP. Den spesifikke målet med denne delen av studien var å kunne rense is og permafrost kjerner. Så vidt vi vet, har ingen metode integrert bruken av løsninger som er utviklet for å eliminere fremmede nukleinsyrer og tilhørende nukleaser fra den ytre del av de frosne kjerner. Dette er til tross for det faktum at disse løsningene er commonly brukes til å rense laboratorieutstyr for molekylære eksperimenter.

Når kjernene ble dekontaminert, ble genomisk DNA ekstrahert ved hjelp av de protokoller som er utviklet av Griffiths et al., ²³ og hå et al. ^24, kvantifisert ved anvendelse av et spektrofotometer, og fortynnet med sterilt, DNA-fritt vann for å oppnå 20 ng pr reaksjon. Bakterielle 16S rRNA gener ble forsterket med primere 331F og 797R og undersøke BacTaq ²⁵ og archaeal 16S rRNA gener ble forsterket med primere Arch 349F og Arch 806R og sonden TM Arch 516F ²⁶ under følgende betingelser: 95 ° C i 600 sek etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 60 sek, og 72 ° C i 25 sek med endelig forlengelse ved 40 ° C i 30 sek. Alle qPCR reaksjonene ble utført i duplikat. De 20 ul reaksjonsvolumer inkludert 20 ng DNA, 10 pM av primere, 5 uM av sonden, og 10 pl av qPCR reaksjonsblandingen. standarder for bakteriell og archaeal qPCR ble fremstilt ved anvendelse av genomisk DNA fra Pseudomonas fluorescens og Halobacterium salinarum, respektivt. Begge ble dyrket for å logge fase. Platetellinger ble utført, og DNA ble isolert fra kulturene. Genomisk DNA ble kvantifisert med et spektrofotometer med forutsetningen om en og seks kopier av 16S rRNA-genet per genom for H. salinarum og P. fluorescens, henholdsvis ^27-28. Kopier antall bakterie og archaeal genene ble beregnet ut fra standardkurven, log-transformeres til å gjøre rede for ulike avvik mellom behandlingene, og vurdert av ANOVA.

Fellesskapet sammensetning ble bestemt ved sekvensering av 16S rRNA-genet ved hjelp av flyt celler og bro forsterkerteknologi og analysere samfunn med kvantitative innsikt i mikrobiell økologi "(QIIME) ^29. Forover og revers leser ble slått sammen og deretter sekvenser ble filtrert, indeksert,og representanter høy kvalitet ble valgt for de novo operative taksonomiske enheter (Otu) oppdraget gjennom sekvenssammenstillingen med en referansedatabase. Innrettede sekvenser ble sammenlignet med en separat referansedatabase for taksonomisk oppdrag. En Otu tabellen phylum nivå ble opprettet for å avgjøre generelle samfunnet sammensetning.

Protocol

1. Utstyr Forberedelse og Permafrost kjernesamling Utstyr forberedelse og felt prøvetaking og bevaring utstyr Monter skrue for prøvetaking ved å sette stasjonsadapteren inn i toppen av sylinderen og vri spaken for å låse den på plass. Fest adapteren rør på stasjonsadapteren og pin motoren på adapteren røret. Sett skjærene på fat. Bruk lette varebiler dresser, nitrilhansker, og masker for å redusere forurensning til prøvene. Bruk hørselvern og hjelm for sikkerhet ved å skrive…

Representative Results

Den presenterte metoden kan brukes til å rense frosne prøver samlet inn fra ulike kryosfære miljøer, fra breis til permafrost. Her presenterer vi data spesielt innhentet fra is og permafrost prøver samlet fra Engineering Research and Development Center – Cold Regions Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel ligger i Fox, AK (figur 1A og 1B). Den Permafrost Tunnel strekker seg ca 110 m inn i siden av Goldstream dalen og gir …

Discussion

Kryosfæren tilbyr tilgang til bevarte organismer som vedvarte etter siste miljøforhold. Selv om den gjen taxa ikke kan representere hele historiske fellesskapet, kan de som utvinnes fra analyse av breis og permafrost prøver gi verdifull historisk informasjon om utvalgte tidsperioder ^15-16. For eksempel har menings biologisk informasjon er hentet fra isen studier som undersøker anaerob aktivitet i isdekket på Grønland ²⁰ og permafrost studier som undersøker karbon sykkel prosesser som følge …

Materials

Auger	Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK	N/A
70% Isopropanol	Walmart	551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7010
RNase decontamination solution, RNase Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7002
Light Duty Suits	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	10606
Nitrile Gloves	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FFS-700
Antiviral Masks	Curad, Walgreens	CUR3845
Sterile Sample Bags	Nasco, Fort Atkinson, WI	B01445
Steel Microtome Blade	B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC	N/A
Metal Rack	Fabricated at CRREL, Hanover, NH	N/A
Tray	Handy Paint Products, Chanhassen, MN	7500-CC
Aluminum Foil	Western Plastics, Temecula, CA	N/A
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter	Corning, Corning, NY	430513
Serratia marcescens	ATCC, Manassas, VA	17991
Biosafety Hood	NuAire, Plymouth, MN	NU-425-400
Petri Dish	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone	Acros Organics, NJ	61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
ATCC Agar 181- Agar	Difco, Sparks, MD	214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System	Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	12224-50
Ear Protection	Elvex	EP-201
Hard Hat	N/A	N/A
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	34705
Glass Wool	Pyrex	430330
Ruler	N/A	N/A
Weighing Tin	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-732-100
Sodium chloride	Sigma Aldrich, St Louis, MO	S-9625
Potassium chloride	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3040-04
Potassium phosphate, monobasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3246-01
Potassium phosphate, dibasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes	Corning, Corning, NY	4558
2 ml Microcentrifuge Tubes	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13113-50
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE	1437520
Balance	Ohaus, Parsippany, NJ	E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)	Acros Organics, NJ	22716-5000
Polyethylene glycol 8000	Sigma Aldrich, St Louis, MO	P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1752-400
Centrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C0549-1PT
TE Buffer	Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE	AM9860
Pipets	Rainin, Woburn, MA	Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets
Pipet tips	Rainin, Woburn, MA	Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul
Vortexor	Scientific Industries, Bohemia, NY	G-560
Vortex Adaptor	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13000-V1
Clear Bottle	Corning, Corning, NY	C1395500
Amber Bottle	Corning, Corning, NY	C5135250
Bottle Top Filters, 0.22um	Corning, Corning, NY	430513
60 mL Syringe	Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ	BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm	EMD Millipore, Billerica, MA	SLGV033RB
70% Ethanol	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP2818-500	diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	151030511
Cell Spreader	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-100-10
Disposable Inoculating Loops	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-363-602