Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sequencing en genotypering op basis van studies, met inbegrip van Genome-Wide Association Studies (GWAS), kandidaat locus studies, en diep-sequencing studies, hebben veel genetische varianten die statistisch worden geassocieerd met een ziekte, trek, of fenotype geïdentificeerd. Anders dan vroege voorspellingen meeste van deze varianten (85-93%) zijn in niet-coderende gebieden en niet de aminozuursequentie van eiwitten ^1,2 niet veranderen. De functie van deze niet-coderende varianten interpreteren en die de biologische mechanismen ze op de geassocieerde ziekte heeft eigenschap of fenotype bewezen uitdagende ^3-6. genexpressie – We hebben een algemene strategie om de moleculaire mechanismen die varianten verwijzen naar een belangrijk tussenproduct fenotype te identificeren ontwikkeld. Deze leiding is speciaal ontworpen om modulatie van TF binding door genetische varianten te identificeren. Deze strategie combineert computationele benaderingen en moleculair biologische technieken om te voorspellenbiologische effecten van kandidaat-varianten in silico en controleer deze voorspellingen empirisch (figuur 1).

Figuur 1:.. Strategische aanpak voor de analyse van niet-coderende genetische varianten stappen die niet zijn opgenomen in de gedetailleerde protocol in verband met dit manuscript zijn grijs Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In veel gevallen is het belangrijk om te beginnen uitbreiding van de lijst van varianten die allemaal in hoge linkage-onevenwicht (LD) met elkaar verbonden statistisch variant omvatten. LD is een maat voor niet-willekeurige associatie van allelen op twee verschillende chromosomale posities, die kan worden gemeten door de r ^{2 7} statistiek. r ² is een maat voor de linKage onevenwichtigheid tussen twee varianten, met een r ² = 1 aangeeft perfecte verbinding tussen twee varianten. Allelen hoge LD blijken co-segregeren op het chromosoom in voorouderlijke populaties. Huidige genotypering arrays niet alle bekende varianten in het menselijk genoom. In plaats daarvan gebruik maken van de LD in het menselijk genoom en omvatten een subset van de bekende varianten die als proxies voor andere varianten binnen een bepaalde regio van LD ^8. Aldus kan een variant zonder biologische gevolg worden geassocieerd met een bepaalde ziekte omdat het in LD met de causale variant-de variant met een zinvolle biologisch effect. Procedureel, is het raadzaam om te zetten van de nieuwste versie van de 1000 genomen projecteren ⁹ variant call-bestanden (VCF) in binaire bestanden compatibel zijn met Plink ^10,11, een open-source tool voor het gehele genoom vereniging analyse. Vervolgens worden alle andere genetische varianten met LD r ^2> 0,8 bij elke ingang genetische variant kunnen worden geïdentificeerd als kandidaten. Het is belangrijk om de overeenkomstige referentiegroep voor dit stap- bijvoorbeeld als een variant geïdentificeerd bij personen van Europese afkomst, de data van onderwerpen van soortgelijke afkomst moeten worden gebruikt voor LD expansie.

LD expansie resulteert vaak in tientallen kandidaat varianten, en het is waarschijnlijk dat slechts een klein deel daarvan bijdragen aan ziektemechanisme. Vaak is onhaalbaar experimenteel onderzoeken elk van deze varianten afzonderlijk. Daarom is het nuttig om de duizenden publiekelijk beschikbare functionele genomische datasets te benutten als een filter om voorrang te geven aan de varianten. Zo heeft de ENCODE consortium ¹² duizenden ChIP-seq experimenten waarin de binding van TF en co-factoren en histon markeringen uitgevoerd in diverse contexten, samen met chromatine bereikbaarheidsgegevens van technologieën zoals DNase-seq ^13, ATAC -seq ¹⁴ en FAIRE-seq ^15. databases en webservers zoals de UCSC Genome Browser ^16, Roadmap Epigenomics ^17, Blueprint Epigenome ^18, Cistrome ¹⁹ en Remap ²⁰ bieden gratis toegang tot de gegevens die door deze en andere experimentele technieken in een breed scala van celtypen en voorwaarden. Wanneer er te veel varianten experimentele onderzoeken, kunnen deze gegevens worden gebruikt om prioriteit die zich binnen waarschijnlijk regulerende gebieden desbetreffende cel- en weefseltypen. Verder wanneer een variant binnen een ChIP-seq piek voor een specifiek eiwit, deze gegevens kunnen potentiële leads geven over de specifieke TF (s) of co-factoren waarvan de binding zou kunnen beïnvloeden.

Vervolgens worden de resulterende prioriteit varianten experimenteel gescreend om voorspelde genotype-afhankelijke eiwit binding te valideren met behulp van EMSA ^21,22. EMSA meet de verandering in de migratie van de oligo op een niet-reducerende TBE gel. Fluorescent gemerkte oligo wordt geïncubeerd met denucleaire lysaat en binding van nucleaire factoren de beweging van de oligo vertragen op de gel. Op deze wijze oligo dat meer kernfactoren is gebonden zal een sterker fluorescentiesignaal op scantoepassingen. Met name EMSA geen voorspellingen over de specifieke eiwitten waarvan de binding zal worden beïnvloed vereisen.

Zodra varianten zijn geïdentificeerd die zich binnen het voorspelde regelende gebieden en kunnen verschillend binding kernfactoren zijn computationele werkwijzen toegepast om de specifieke TF (n) waarvoor bindende ze invloed kunnen voorspellen. Wij geven de voorkeur aan CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UniProbe ²⁶ en JASPAR ²⁷ gebruiken. Zodra de kandidaat-TF's worden geïdentificeerd, kunnen deze voorspellingen specifiek worden getest met behulp van antilichamen tegen deze TF's (EMSA-supershifts en DAPA-Westerns). Een EMSA-supershift bij de bereiding een TF-antilichamen voor de nucleaire lysaat en oligo. Een positief resultaat in een EMSA-supershift is represented een verdere verschuiving in de EMSA band, of een verlies van de band (besproken in referentie ^28). In de complementaire DAPA, een 5'-gebiotinyleerde oligo duplex die de variant en 20 basenparen flankerende nucleotiden zijn geïncubeerd met nucleaire lysaat uit relevante type (s) cel nucleaire factoren die specifiek binden de oligo vangen. De duplex-oligo nucleaire factor complex geïmmobiliseerd op streptavidine microkralen in een magnetische kolom. De gebonden nucleaire factoren worden rechtstreeks verzameld via elutie ^29,48. Bindende voorspellingen kunnen dan worden beoordeeld door een Western blot met gebruik van antilichamen specifiek voor het eiwit. In gevallen waarin er geen duidelijke voorspellingen, of te veel voorspellingen, de eluties van variant pull-downs van de DAPA experimenten kan een proteomics kern worden gestuurd om de kandidaat-TF's te identificeren met behulp van massaspectrometrie, die vervolgens kunnen worden gevalideerd met behulp van deze eerder beschreven werkwijzen.

In de rest van de article, is de gedetailleerde protocol voor het EMSA en DAPA analyse van genetische varianten voorzien.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen en reagentia Bestel aangepaste DNA oligonucleotide probes voor gebruik in EMSA en DAPA. Om niet-specifieke eiwit binding te verminderen, het ontwerpen van korte oligo (tussen 35-45 basenparen (bp) in de lengte) 30, en plaats de variant van belang direct in het centrum geflankeerd door de 17 bp endogene genoomsequentie. Voor EMSA oligo's, voeg een 5 'fluorofoor. Voor DAPA oligo's, voeg een 5 'biotine tag. Bestel zowel de sense streng en…

Representative Results

In dit hoofdstuk worden representatieve resultaten van wat te verwachten op voorwaarde bij het uitvoeren van een EMSA of DAPA, en de variabiliteit met betrekking tot de kwaliteit van het lysaat wordt gekenmerkt. Bijvoorbeeld is gesuggereerd dat invriezen en ontdooien eiwitmonsters meerdere keren kan leiden tot denaturatie. Om de reproduceerbaarheid van EMSA analyse verkennen in de context van deze "bevriezen-ontdooien" cycli, twee 35 bp oligo verschillen op een genetische varia…

Discussion

Hoewel vooruitgang in sequencing en genotypering technologieën zijn sterk verbeterd ons vermogen om genetische varianten geassocieerd met de ziekte te identificeren, is ons vermogen om de functionele mechanismen beïnvloed door deze varianten begrijpen achter. Een belangrijke bron van het probleem is dat veel ziekte-geassocieerde varianten liggen in n on-coderende gebieden van het genoom, die waarschijnlijk van invloed moeilijker te voorspellen mechanismen die genexpressie. Hier presenteren we een protocol gebase…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES