Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sequenzierung und Genotypisierung basierte Studien, einschließlich der genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Kandidaten-Locus Studien und tiefSequenzierungsUntersuchungen haben viele genetische Varianten identifiziert, die statistisch im Zusammenhang mit einer Krankheit, Zug oder Phänotyp. Im Gegensatz zu dem frühen Vorhersagen, die meisten dieser Varianten (85-93%) werden in nicht-codierenden Regionen und die Aminosäuresequenz von Proteinen nicht ^1,2 ändern. Interpretieren der Funktion dieser nicht-kodierenden Varianten und Bestimmung der biologischen Mechanismen , um sie zu dem zugeordneten Krankheit verbindet, trait oder Phänotyp hat Herausforderung erwiesen ^3-6. Wir haben eine allgemeine Strategie entwickelt, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die Varianten zu einem wichtigen Zwischen Phänotyp verknüpfen – Genexpression. Diese Pipeline wird speziell zu identifizieren, die Modulation der TF-Bindung durch genetische Varianten entwickelt. Diese Strategie kombiniert Rechenansätze und Techniken der Molekularbiologie Ziel vorherzusagenbiologische Wirkungen von Kandidatenvarianten in silico, und überprüfen diese Prognosen empirisch (Abbildung 1).

Abbildung 1:.. Strategischer Ansatz für die Analyse von nicht-kodierenden genetischen Varianten Schritte, die in der detaillierten Protokoll sind nicht mit diesem Manuskript assoziiert enthalten sind grau schattiert Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In vielen Fällen ist es wichtig, durch eine Erweiterung der Liste der Varianten zu beginnen alle, die in hohen Gestänge-Ungleichgewichts (LD) mit jeder statistisch assoziiert Variante enthalten. LD ist ein Maß der nicht-zufällige Assoziation von Allelen an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen, die durch die r ² -Statistik ⁷ gemessen werden kann. r ² ist ein Maß für die linKage Ungleichgewichts zwischen zwei Varianten, mit einem r ² = 1 bezeichnet perfekte Verbindung zwischen zwei Varianten. Allelen in hohen LD gefunden auf dem Chromosom über Vorfahren Populationen zusammen entmischen. Aktuelle Genotypisierung Arrays enthalten nicht alle bekannten Varianten im menschlichen Genom. Stattdessen verwerten sie die LD innerhalb des menschlichen Genoms und sind eine Teilmenge der bekannten Varianten , die ⁸ für andere Varianten innerhalb einer bestimmten Region des LD als Stellvertreter fungieren. Somit kann mit einer bestimmten Krankheit assoziiert sein eine Variante ohne biologische Folge kann, da es in LD mit dem kausalen varianten der Variante mit einer sinnvollen biologischen Wirkung. Prozedural, wird empfohlen , die neueste Version der 1000 Genome Projekt ⁹ Variante Call – Dateien (VCF) in binäre Dateien zu konvertieren kompatibel mit PLINK ^10,11, einem Open-Source – Tool für Genom – Assoziations – Analyse. Anschließend werden alle anderen genetischen Varianten mit LD r ^2> 0,8 mit jedem Eingang genetischen variant als Kandidaten identifiziert werden. Es ist wichtig , die entsprechende Referenzpopulation für diese Schritt- zB zu verwenden, wenn eine Variante , bei Themen von europäischer Abstammung identifiziert wurde, Daten von Patienten mit ähnlicher Herkunft sollte für LD Expansion verwendet werden.

LD Expansion resultiert oft in Dutzenden von Kandidatenvarianten, und es ist wahrscheinlich, dass nur ein kleiner Bruchteil von diesen zu Krankheitsmechanismus beizutragen. Oft ist es nicht durchführbar, experimentell jede dieser Varianten einzeln untersuchen. Es ist daher sinnvoll, die Tausende von öffentlich verfügbaren funktionellen genomischen Datensätze als Filter zu nutzen, um die Varianten zu priorisieren. Zum Beispiel ¹² das ENCODE – Konsortium hat Tausende von ChIP-seq Experimente beschreiben die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren, und Histonmarkierungen in einem breiten Spektrum von Kontexten, zusammen mit Chromatin Zugänglichkeit von Daten von Technologien wie DNase-seq ^13, ATAC ausgeführt -SEQ ¹⁴ und FAIRE-seq ^15. DatabAses und Web – Servern wie dem UCSC Genome Browser ^16, Roadmap Epigenomics ^17, Epigenome Blueprint ^18, Cistrome ¹⁹ und ReMap ²⁰ bieten freien Zugang zu Daten , die durch diese und andere experimentelle Techniken in einer Vielzahl von Zelltypen und Bedingungen hergestellt. Wenn es zu viele Varianten sind experimentell zu untersuchen, können diese Daten verwendet werden, die innerhalb wahrscheinlich regulatorischen Regionen in entsprechenden Zell- und Gewebetypen angeordnet zu priorisieren. Ferner wird in Fällen, in denen eine Variante für ein spezifisches Protein in einer ChIP-seq peak ist, können diese Daten Potential führt als der spezifischen TF (s) oder Cofaktoren schaffen, deren Bindung könnte beeinflussen.

Als nächstes werden die resultierenden priorisiert Varianten gescreent experimentell vorhergesagt Genotyp-abhängige Protein zu validieren Bindungs ^​​21,22 mittels EMSA. EMSA misst die Veränderung in der Migration des oligo auf einem nicht-reduzierenden TBE-Gel. Fluoreszierend markiertes Oligo mit der inkubiertenKern Lysat, und die Bindung von Kernfaktoren wird verzögern die Bewegung des Oligo auf dem Gel. Auf diese Weise Oligo, die mehr Kernfaktoren gebunden hat, als ein stärkeres Fluoreszenzsignal beim Abtasten präsentieren wird. Bemerkenswert ist, erfordert keine EMSA Prognosen über die spezifischen Proteine, deren Bindung betroffen.

Sobald Varianten identifiziert werden, die innerhalb der erwarteten regulatorischen Regionen befinden und in der Lage sind unterschiedlich Bindung Kernfaktoren sind Berechnungsverfahren die spezifische TF (s), dessen vorherzusagen verwendet Bindung sie beeinflussen könnten. Wir bevorzugen CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UNIProbe ²⁶ zu verwenden, und JASPAR ^27. Sobald Kandidaten TFs identifiziert werden, können diese Prognosen ausdrücklich Antikörper gegen diese TFs (EMSA-supershifts und DAPA-Westerns) getestet werden. Eine EMSA-Supershift beinhaltet die Zugabe eines TF-spezifischen Antikörpers an das Kern Lysat und Oligo. Ein positives Ergebnis in einem EMSA-Supershift ist represented als eine weitere Verschiebung der EMSA Band oder einem Verlust des Bandes (in Bezug ²⁸ überprüft). In der komplementären DAPA, eine 5'-biotinylierten Oligokomplexes die Variante und das 20 Basenpaar-flankierenden Nukleotide enthalten, werden mit nuklearen Lysat von relevanten Zelltyp (en) inkubiert alle Kernfaktoren speziell zur Erfassung der Oligos binden. Die Oligokomplexes-nuclear factor-Komplex wird durch Streptavidin-Mikrokügelchen in einer magnetischen Säule immobilisiert. Die gebundenen Kernfaktoren werden direkt durch Elution ^29,48 gesammelt. Bindungsvorhersagen können dann durch Western-Blot untersucht werden, um Antikörper, spezifisch für das Protein verwendet wird. In Fällen, in denen es keine offensichtlichen Prognosen oder zu viele Vorhersagen, die Elutionen von Variante Pull-downs der DAPA Experimente können zu einem Proteomik Kern gesendet werden, um Kandidaten TFs mit Massenspektrometrie identifizieren, die anschließend validiert werden können mit diesen zuvor beschriebenen Methoden.

In dem Rest des article wird das detaillierte Protokoll für EMSA und DAPA Analyse genetischer Varianten vorgesehen.

Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Reagenzien Bestellen Sie kundenspezifische DNA-Oligonukleotid-Sonden zur Verwendung in EMSA und DAPA. Zur Reduzierung der unspezifischen Proteinbindung, entwerfen kurze Oligos (zwischen 35-45 Basenpaare (bp) in der Länge) 30, und legen Sie die Variante von Interesse direkt in der Mitte , flankiert von seinen 17 bp endogene genomische Sequenz. Für EMSA Oligos, eine 5'-Fluorophor hinzuzufügen. Für DAPA Oligos, eine 5'-Biotin-Tag hinzufügen. …

Representative Results

In diesem Abschnitt repräsentative Ergebnisse von dem, was zu erwarten, zur Verfügung gestellt, wenn ein EMSA oder DAPA Durchführung und die Variabilität in Bezug auf die Qualität des Lysats gekennzeichnet ist. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass mehrere Male Einfrieren und Auftauen Proteinproben in Denaturierung führen kann. Um die Reproduzierbarkeit der EMSA-Analyse im Rahmen dieser "Frost-Tau" Zyklen, zwei 35 bp Oligos unterschiedlichen an einer genetischen Varian…

Discussion

Obwohl Fortschritte in der Sequenzierung und Genotypisierung Technologien stark unsere Fähigkeit, mit der Krankheit genetische Varianten assoziiert zu identifizieren verbessert haben, unsere Fähigkeit, die Funktionsmechanismen von diesen Varianten betroffen zu verstehen, hinkt. Eine wichtige Ursache des Problems ist, dass viele krankheitsassoziierten Varianten in n angeordnet sind on-kodierenden Regionen des Genoms, die wahrscheinlich Einfluss auf schwieriger zu sagen voraus Mechanismen Genexpression steuern. Hi…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES