Screening för funktionell icke-kodande genetiska varianter Använda Elektro Mobility Shift Assay (EMSA) och DNA-affinitet Nederbörd analys (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Sekvensering och genotypning baserade studier, inklusive Genomvid associationsstudier (GWAS), kandidat locus studier och djupsekvense studier har identifierat många genetiska varianter som statistiskt är associerade med en sjukdom, drag eller fenotyp. I motsats till tidigare prognoser, de flesta av dessa varianter (85-93%) är belägna i icke-kodande regioner och ändrar inte aminosyrasekvensen av proteiner ^1,2. Tolka funktion av dessa icke-kodande varianter och bestämma de biologiska mekanismerna som förbinder dem till associerad sjukdom, har drag, eller fenotyp visat utmanande ^3-6. Vi har utvecklat en övergripande strategi för att identifiera de molekylära mekanismer som länkar varianter till en viktig mellan fenotyp – genuttryck. Denna pipeline är särskilt utformade för att identifiera moduleringen av TF bindning av genetiska varianter. Denna strategi kombinerar beräkningsmetoder och molekylärbiologiska tekniker som syftar till att förutsägabiologiska effekter av kandidat varianter i silico och verifiera dessa förutsägelser empiriskt (Figur 1).

Figur 1:.. Strategi för analys av icke-kodande genetiska varianter Steg som inte ingår i den detaljerade protokoll i samband med detta manuskript är skuggade i grått Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I många fall är det viktigt att börja med att utöka listan över varianter att omfatta alla de i hög linkage-ojämvikt (LD) med varje statistiskt samband variant. LD är ett mått på icke-slumpmässigt association av alleler vid två olika kromosomala positioner, som kan mätas av r ² statistik ^7. r ² är ett mått på linKage obalans mellan två varianter, med en r ² = 1 betecknar perfekt koppling mellan två varianter. Alleler i hög LD befinns samtidigt segregera på kromosomen över släkt- befolkningar. Nuvarande genotypning arrayer inkluderar inte alla kända varianter i det mänskliga genomet. Istället utnyttjar LD inom det mänskliga genomet och inkludera en delmängd av de kända varianter som fungerar som ombud för andra varianter inom en viss region i LD ^8. Således kan en variant utan någon biologisk konsekvens vara associerad med en särskild sjukdom eftersom det är i LD med orsaks variant-varianten med en meningsfull biologisk effekt. Procedurmässigt är det rekommenderat att konvertera den senaste versionen av 1000 genomen projektet ⁹ variant samtals filer (VCF) till binära filer som är kompatibla med Plink ^10,11, ett open-source verktyg för hela genomet associationsanalys. Därefter alla andra genetiska varianter med LD r ^2> 0,8 med varje ingång genetisk variant kan identifieras som kandidater. Det är viktigt att använda den tillämpliga referenspopulationen för denna steg t ex om en variant identifierades i frågor av europeisk härkomst, data från patienter med liknande härkomst ska användas för LD expansion.

LD expansionen resulterar ofta i dussintals kandidat varianter, och det är troligt att endast en liten del av dessa bidrar till sjukdomsmekanismen. Ofta är det omöjligt att experimentellt undersöka var och en av dessa varianter individuellt. Det är därför lämpligt att utnyttja de tusentals offentligt tillgängliga funktionsgenomiska datamängder som ett filter för att prioritera varianter. Till exempel har ENCODE konsortiet ¹² utfört tusentals Chip-punkter experiment som beskriver bindningen av TF och co-faktorer, och histon märken i en rad olika sammanhang, tillsammans med kromatin tillgänglighetsdata från teknik såsom DNas-punkter ^13, ATAC -seq ^14, och FAIRE-seq ^15. DatabALL och webbservrar som UCSC Genome Browser ^16, färdplan Epigenomics ^17, Blueprint Epigenome ^18, Cistrome ^19, och mappa ²⁰ ger fri tillgång till data som produceras av dessa och andra experimentella metoder inom ett brett spektrum av celltyper och villkor. När det finns för många varianter att undersöka experimentellt, kan dessa data användas för att prioritera de som ligger inom troliga reglerande regioner inom relevanta cell- och vävnadstyper. Vidare, i de fall där en variant inom en chip-punkter topp för ett specifikt protein, kan dessa uppgifter ger potentiella kunder som den specifika TF (s) eller co-faktorer vars bindning kan påverka.

Därefter de resulterande prioriterade varianter screenas experimentellt att validera förutspått genotyp beroende proteinbindning med hjälp av EMSA ^21,22. EMSA mäter förändringar i migreringen av oligo på en icke-reducerande TBE-gel. Fluorescensmärkt oligo inkuberas mednukleära lysat, och bindning av nukleära faktorer kommer att fördröja rörelsen av oligo på gelén. På detta sätt, oligo som har bunden fler nukleära faktorer kommer att presentera som en starkare fluorescerande signal vid scanning. Noterbart är inte EMSA inte kräva förutsägelser om de specifika proteiner vars bindning kommer att påverkas.

När varianter identifieras som är belägna inom förutsedda regulatoriska regioner och är i stånd att differentiellt bindande kärn faktorer, är beräkningsmetoder som används för att förutsäga specifika TF (s) vars bindande de kan påverka. Vi föredrar att använda CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ²⁵ UniProbe ^26, och Jaspar ^27. När kandidat TF har identifierats, kan dessa förutsägelser specifikt testas med hjälp av antikroppar mot dessa TF (EMSA-supershifts och DAPA-Westerns). En EMSA-supershift innebär tillsättning av en TF-specifik antikropp mot den nukleära lysat och oligo. Ett positivt resultat i en EMSA-supershift är represented som en ytterligare förskjutning i EMSA-bandet, eller en förlust av bandet (översikt i referens ^28). I den komplementära DAPA är en 5'-biotinylerad oligo duplex innehållande varianten och 20 baspar som flankerar nukleotider inkuberas med kärn lysat från relevant celltyp (s) för att fånga några nukleära faktorer som specifikt binder oligos. Oligo duplex-nukleär faktor komplexet immobiliseras genom streptavidin mikropärlor i en magnetisk kolonn. De bundna nukleära faktorer samlas direkt genom eluering ^29,48. Bindande prognoser kan sedan bedömas av en Western blöt med användning av antikroppar som är specifika för proteinet. I de fall där det inte finns några uppenbara förutsägelser, eller alltför många förutsägelser, de elueringar från variantrullgardinsmenyerna av DAPA experiment kan skickas till en proteomik kärna för att identifiera kandidat TF använder masspektrometri, som därefter kan valideras med hjälp av dessa tidigare beskrivna metoder.

I återstoden av article är den detaljerade protokoll för EMSA och DAPA analys av genetiska varianter tillhandahålls.

Protocol

1. Beredning av lösningar och reagenser Beställa anpassade DNA oligonukleotidsonder för användning i EMSA och DAPA. För att minska icke-specifik proteinbindning, designa korta oligonukleotider (mellan 35-45 baspar (bp) i längd) 30, och placera variant av intresse direkt i mitten flankerad av sin 17 bp endogena genomsekvensen. För EMSA oligos, lägga till en 5 'fluorofor. För DAPA oligos, lägga till en 5 "biotin tag. Beställ både senssträngen och dess omvända…

Representative Results

I detta avsnitt är representativa resultat av vad som väntar under förutsättning när man utför en EMSA eller DAPA, och variationen när det gäller kvaliteten på lysatet karaktäriseras. Exempelvis har det föreslagits att frysning och upptining proteinprover flera gånger kan resultera i denaturering. För att undersöka reproducerbarheten av EMSA-analys i samband med dessa "frys-tö" cykler, var två 35 bp oligos skiljer sig på en genetisk variant inkuberas med ett en…

Discussion

Även framsteg inom sekvensering och genotypning teknik har förbättrats avsevärt vår förmåga att identifiera genetiska varianter i samband med sjukdom, är vår förmåga att förstå de funktionella mekanismer påverkas av dessa varianter släpar. En viktig källa till problemet är att många sjukdomsassocierade varianter finns i n på-kodande regioner av genomet, vilket sannolikt påverkar hårdare mot förutse mekanismer som styr genuttryck. Här presenterar vi ett protokoll baserat på EMSA och DAPA tek…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES