Hjerteinfarkt i Neonatal mus, en modell av Cardiac Regeneration

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

Hjerteinfarkt indusert av koronar ligation har vært brukt i mange dyremodeller som et verktøy for å studere mekanismene for hjerte reparasjon og regenerering, og å definere nye mål for behandlingsformer. I flere tiår, modeller av komplett hjerte regenerering eksisterte i amfibier og fisk, men et pattedyr motstykke var ikke tilgjengelig. Den nylige oppdagelsen av en postnatal vindu der mus har regenerative evner har ført til etablering av et pattedyr modell av hjerte regenerering. En kirurgisk modell av pattedyr hjerte regenerering i nyfødt mus er presentert her. Kort fortalt er postnatal dag 1 (P1) mus bedøvd av isofluran og plassert på en is pad for å indusere hypotermi. Etter at brystkassen er åpnet, og den venstre fremre nedstigende koronararterie (LAD) er anskueliggjort, er en sutur plassert rundt LAD å påføre myokardial ischemi i den venstre ventrikkel. Den kirurgiske prosedyren tar 10-15 min. Visualisere koronararterieavgjørende for nøyaktig sutur plassering og reproduserbarhet. Hjerteinfarkt og hjertesvikt er bekreftet av trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) farging og ekkokardiografi, henholdsvis. Komplett regenerering 21 dager etter hjerteinfarkt er bekreftet ved histologi. Denne protokollen kan bli brukt som et verktøy for å forstå mekanismene for pattedyrhjerte regenerering etter hjerteinfarkt.

Introduction

Hjerteinfarkt (MI) er en ledende dødsårsaken i verden, og er fortsatt ansvarlig for om lag en tredel av hjertesvikt tilfeller ^1. Mens bruk av perkutan intervensjon og kontinuerlig optimalisering av bruken av trombolytisk reperfusjon har økt følgende MI, kardiomyocytt død og tap av kontraktile myokard likevel inntreffer. Det gjenstår også et stort antall "no-alternativet" pasienter som ikke er kandidater for eller ikke ser nytte av disse tiltakene. Disse pasientene fortsetter å oppleve invalid iskemi fører til arrdannelse og skadelig ventrikkel ombygging som en mekanisme for infarkt healing. Denne prosessen til slutt resulterer i hjertesvikt, der prognosen er fortsatt dårlig til tross for optimal farmakologisk styring med angiotensin-konvertering enzym (ACE) hemmere og betablokkere. Dessverre er fremdeles ett års dødelighet for pasienter med alvorlig nedsatt venstre ventrikkelfunksjon somhøy som 26% ^2. Hjertetransplantasjon er det siste behandlingsalternativ for pasienter med hjertesvikt. Imidlertid ikke begrenset donor pool for hjertetransplantasjon ikke gjøre dette til et levedyktig alternativ for de fleste pasienter. Dermed oppdagelsen av nye terapeutiske midler for å gjenopprette den skadede hjertemuskelen er fortsatt viktig å løse hjertesykdom problem. Pålitelig dyremodeller av hjerteskade er derfor nødvendig som en viktig del av denne prosessen.

Tradisjonell dogme har diktert at voksne cardiomyocytes er post-mitotisk, terminalt differensierte celler, ute av stand til å dele eller de-differensierende å erstatte den skadede hjertemuskelen ^tre. Som sådan, kan en voksen pattedyr hjerte aldri helt seg selv igjen fra skade, og tapte cardiomyocytes ville bli erstattet med bindevev. Dermed har forskningen fokusert primært på terapeutiske midler for å redusere infarkt ekspansjon og redusere arrdannelse. Mer nylig har imidlertid et paradigmeskifte skjeddei tenkningen rundt hjerte healing og mange forskningsinnsats er blitt omdirigert til å fokusere på potensialet for hjerte regenerering ^4.

Inntil nylig var in vivo studier av hjerte regenerering begrenset til ikke-virveldyr modeller, slik som de i urodele amfibier og teleost fisk ^5-7. Imidlertid har oppdagelsen av kapasiteten for hjerte regenerering i neonatale mus førte til utviklingen av to kirurgiske modeller av pattedyrhjerte regenerering: reseksjon av kardial apex og koronar arterieokklusjon å indusere hjerteinfarkt ^8,9. I 2011 ble en mus apex reseksjon modellen som brukes for å vise at fullstendig hjerte regenerering er mulig ved postnatal dag 1 (P1). Men avtar denne kapasiteten raskt etter den første nyfødtperioden. Pattedyr hjertet mister sin regenererende potensial kort tid etter fødselen på P7 som stamcelle tall nedgang, og cardiomyocytes bli binucleated, taperderes proliferative kompetanse, og permanent avslutte cellesyklusen ^10,11. Forstå grunnleggende forskjeller mellom den neonatale og voksne pattedyr hjerte kan føre til ny innsikt i hjerte gjenfødelse.

Mens apex reseksjon faktisk gir innblikk i re-veksten av kontraktile vev, gjør modellen ikke simulere typisk menneskelig hjerteskade, og dermed ikke egner seg så vel til utvikling av legemiddel. Koronar okklusjon modell, men simulerer mer direkte de patofysiologiske aspekter av MI patologi, og dermed kan gi mer nyttig innsikt i mekanismene som kan være aktuelt for terapeutisk avansement for menneskelig bruk.

Kirurgisk koronarligering er blitt anvendt som en nyttig eksperimentell teknikk i mange dyremodeller ^12-14. I den voksne koronarligering modellen blir dyrene bedøvet og intubert for å tillate åpning av brysthulen under opprettholdelse respiratipå. Hjertet fortsetter å slå regelmessig, tillater visualisering av koronar blodkar og muliggjør nøyaktig sutur plassering. Videre er det fortsatt hjertet rosa som perfusjon fortsetter, og etter ligation iskemisk hjertemuskelen vises blek, indikerer vellykket koronar ligation. Protokollen er beskrevet i neonatale mus, men er mindre pålitelige som kransarterien ikke er visualisert og kirurgen må anslå hvor plassere sutur ^15. Selv om den generelle anatomi av den koronare blodkar er den samme, enkelte dyr variasjon i den retning og forgrening av LAD eksisterer ^16. Så når "går i blinde," arterien kan lett bli savnet. Andre teknikker slik som ekkokardiografi er da nødvendig for å bekrefte vellykket induksjon av MI, og for å sikre at alle operasjoner resulterer i en tilsvarende infarktstørrelse. Beskrevet her er en forbedring på en nylig publisert metode ^15, hvor posisjonen av LAD kan Estabblert og således LAD kan bli ligert til reproduserbart å indusere MI.

Denne teknikk krever ikke endotracheal intubasjon eller mekanisk ventilasjon, som toraktomi i en hypotermisk tilstand i den neonatale mus ikke resulterer i lungekollaps. Men i tidligere beskrevet metode, alvorlig hypotermi må induseres til poenget med både komplett apnea og opphør av hjerterytmen ^15. Den store begrensning av denne tilnærmingen er at kransarterien ikke lenger perfusert og hjertet synes bleke selv før LAD ligering. I den metode som er beskrevet heri, er koronar visualisering mulig ved et punkt av dvale før dyp nedkjøling og hjerterytmen opphør, med full restitusjon av den neonatale mus etter operasjonen. Denne metoden gir en stor fordel med 100% reproduserbarhet.

Protocol

Hekkende par av C57BL / 6 og CD-1 IG-S mus ble kjøpt fra Charles River. Dyr brukt i denne studien ble håndtert i henhold til retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care, og studieprotokoller ble godkjent av Animal Bruk Subcommittee ved Western University, London, Canada. 1. Animal Care Etter fødselen er fullført, og valpene har vært utgangspunktet ammet av sin mor for et par timer, plassere dem i en annen bur med en CD-en fostermor. CD-en mødre vise et roligere fe…

Representative Results

Den hjerteinfarkt prosedyre på P1 kan være ferdig i 10 – 15 min og har en dødelighet på 7,8% (5 av 64 unger). Etter operasjonen, mus gjenopprette fra hypoterme anestesi innen de neste 5-20 min (tid for utvinning avhenger av kroppstemperaturen nådd under anestesi og hastigheten på kirurg). Ved bruk av P7 unger (for sammenligning med en ikke-regenerativ myokard), er en lengre periode med avkjøling nødvendig for å nå dvale. P7 valpene er mye større og har mer problemer med å kom…

Discussion

Den kirurgiske LAD ligation demonstrert her er en pålitelig metode for å produsere MI i neonatale mus. Denne modellen gir forskere med en reproduserbar modell som å studere pattedyr hjerte regenerering. Visualisering av koronar blodkar er en viktig del av denne metoden, sikrer korrekt sutur plassering og dermed garantere reproduserbarhet. Mens voksne mus ikke har vekselvarme evner, er kroppstemperaturen og metabolic rate av neonatal mus nært forbundet med omgivelsestemperatur. Videre er den lille størrelsen på nyf…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice