Infarto do miocárdio em ratos neonatais, um modelo de regeneração cardíaca

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

enfarte do miocárdio induzido por ligação da artéria coronária tem sido utilizado em muitos modelos animais como uma ferramenta para estudar os mecanismos de reparação e regeneração cardíaca, e para definir novos alvos para terapêuticas. Durante décadas, os modelos de regeneração cardíaca completa existia em anfíbios e peixes, mas uma contrapartida de mamíferos não estava disponível. A recente descoberta de uma janela pós-natal durante o qual os ratinhos possuem capacidades regenerativas levou ao estabelecimento de um modelo de mamífero de regeneração cardíaca. Um modelo cirúrgico de regeneração cardíaca mamíferos no ratinho neonatal é aqui apresentado. Resumidamente, um dia pós-natal (P1), os ratos são anestesiados com isoflurano e colocado sobre uma almofada de gelo para induzir hipotermia. Após o peito é aberto, eo descendente anterior da artéria coronária (LAD) é visualizado, a sutura é colocado ao redor do LAD para infligir isquemia miocárdica no ventrículo esquerdo. O procedimento cirúrgico leva 10-15 min. Visualizando a artéria coronária écrucial para a colocação precisa de sutura e reprodutibilidade. infarto do miocárdio e disfunção cardíaca são confirmados por cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) coloração e ecocardiograma, respectivamente. regeneração completa 21 dias pós-enfarte do miocárdio é verificada por meio de histologia. Este protocolo pode ser utilizado como uma ferramenta para elucidar os mecanismos de regeneração cardíaca após enfarte do miocárdio de mamífero.

Introduction

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morte no mundo, e continua a ser responsável por cerca de um terço dos casos de insuficiência cardíaca ^1. Embora o advento de intervenção percutânea e optimização contínua da utilização de trombolíticos aumentou reperfusão após MI, morte de cardiomiócitos e perda de miocárdio, no entanto, ocorre contráctil. Há também permanecem um grande número de pacientes "não-opção" que não são candidatos para ou não vêem benefício destas intervenções. Esses pacientes continuam a sofrer isquemia incapacitantes que levam à formação de cicatriz e remodelação ventricular nocivo como um mecanismo de cura do enfarte. Este processo resulta em insuficiência cardíaca, para o qual o prognóstico continua pobre apesar de tratamento farmacológico óptimo com enzimas (IECA) de conversão da angiotensina e betabloqueadores. Infelizmente, a taxa de mortalidade de um ano para pacientes com função ventricular esquerda severamente prejudicada ainda permanece comoelevado como 26% ^2. transplante de coração é a opção de tratamento final para pacientes com insuficiência cardíaca. No entanto, o número limitado de dadores para o transplante cardíaco não tornar esta uma opção viável para a maioria dos pacientes. Assim, a descoberta de novos agentes terapêuticos para restaurar a miocárdio danificado permanece fundamental para a resolução do problema de doença cardíaca. modelos animais confiáveis ​​de lesão cardíaca são, portanto, necessários como um componente crítico deste processo.

Dogma tradicional ditou que os cardiomiócitos adultos são pós-mitótico, as células terminalmente diferenciadas, incapaz de dividir ou de-diferenciação para substituir o miocárdio danificado ^3. Como tal, um coração de mamífero adulto nunca poderia recuperar completamente a partir de lesões, e perda de cardiomiócitos seria substituído por tecido fibroso. Assim, a investigação tem-se centrado principalmente em agentes terapêuticos para minimizar a expansão do enfarte e reduzir a formação de cicatriz. Mais recentemente no entanto, uma mudança de paradigma ocorreuno pensamento em torno de cura cardíaco e muitos esforços de pesquisa foram redirecionadas para focar o potencial para regeneração cardíaca ^4.

Até recentemente, o estudo in vivo de regeneração cardíaca foi limitado aos modelos não vertebrados, tais como aqueles em anfíbios e peixes teleósteos urodele ^5-7. No entanto, a descoberta da capacidade de regeneração cardíaca no rato neonatal tem levado ao desenvolvimento de dois modelos cirúrgicos de regeneração cardíaca de mamífero: a ressecção da oclusão da artéria coronária cardíaca ápice e para induzir enfarte do miocárdio ^8,9. Em 2011, um modelo de ressecção ápice do rato foi utilizado para demonstrar que a regeneração cardíaca completa é possível em um dia pós-natal (P1). No entanto, esta capacidade diminui rapidamente após o período neonatal inicial. O coração de mamíferos perde o seu potencial regenerativo logo após o nascimento em P7 como números de células progenitoras declínio e cardiomiócitos ficar binucleadas, perdemsua competência proliferativa, e permanentemente ^10,11 sair do ciclo celular. Entender as diferenças fundamentais entre a neonatal e do coração de mamíferos adultos pode levar a novos insights sobre a regeneração cardíaca.

Enquanto ressecção ápice de facto oferece uma visão sobre re-crescimento do tecido contráctil, o modelo não simula o dano cardíaco humano típico, e, portanto, não se presta, assim como para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. O modelo de oclusão da artéria coronária, no entanto, simula mais diretamente os aspectos fisiopatológicos da MI patologia, e, portanto, pode fornecer insights mais úteis em mecanismos que podem ser aplicáveis ​​ao avanço terapêutico para uso humano.

Ligadura coronária cirúrgica tem sido usada como uma técnica útil experimental em muitos modelos animais ^12-14. No modelo de ligação da artéria coronária adulto, os animais são anestesiados e intubados para permitir a abertura da cavidade torácica, mantendo respiratiem. O coração continua a bater de forma regular, que permite a visualização da vasculatura coronária e permitindo a colocação de sutura precisa. Além disso, o coração permanece rosa como perfusão continua, e após a ligação do miocárdio isquémico parece pálido, indicando a ligação da artéria coronária bem sucedida. O protocolo descrito para ratos neonatais, no entanto, é menos fiável como a artéria coronária não é visualizado e o cirurgião deve estimar onde colocar o fio de sutura ^15. Embora a anatomia geral da vasculatura coronária é a mesma, a variabilidade de animal individual na direcção e ramificação da LAD existe ^16. Assim, quando "indo no escuro", a artéria pode ser facilmente perdida. Outras técnicas, como a ecocardiografia são, então, necessário para confirmar a indução bem-sucedida de MI e para assegurar todas as cirurgias resultam em um tamanho do infarto similar. Aqui descrito é uma melhoria em um método recentemente publicado ^15, onde a posição do LAD pode ser estabecido e, assim, podem ser ligados LAD para induzir de forma reprodutível MI.

Esta técnica não requer entubação endotraqueal ou ventilação mecânica, como toracotomia em estado hipotérmico no ratinho neonatal não resulta em colapso pulmonar. No entanto, no método anteriormente descrito, a hipotermia grave deve ser induzida para o ponto de ambos apneia completa e cessação do ritmo cardíaco ^15. A principal limitação desta abordagem é que a artéria coronária não é perfundido e o coração parece pálido mesmo antes LAD ligadura. Na abordagem aqui descrita, a visualização da artéria coronária é possível a um ponto de torpor antes de hipotermia profunda e cessação do ritmo cardíaco, com total recuperação do rato neonatal após a cirurgia. Este método oferece uma grande vantagem de 100% reprodutibilidade.

Protocol

pares de reprodução de ratinhos CD-1 IG-S ratinhos C57BL / 6 e foram adquiridos a Charles River. Os animais utilizados neste estudo foram tratados de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care e protocolos de estudo foram aprovados pela Subcomissão Use Animal da Universidade Ocidental, London, no Canadá. 1. Animal Care Depois do parto é completa e os filhotes têm sido inicialmente por sua mãe por alguns hr amamentado, colocá-los em uma gaiola diferente, co…

Representative Results

O procedimento de infarto do miocárdio em P1 pode ser concluído em 10 – 15 minutos e tem uma taxa de mortalidade de 7,8% (5 de 64 filhotes). Após a cirurgia, os ratos recuperar da anestesia hipotérmicos no próximo 5-20 min (tempo de recuperação depende a temperatura corporal atingiu durante a anestesia e a velocidade do cirurgião). Ao utilizar crias P7 (por comparação com uma miocárdio não-regenerativa), um longo período de arrefecimento é necessária para alcançar o torpo…

Discussion

A ligadura LAD cirúrgica aqui demonstrada é um método confiável para produzir MI em ratinhos neonatais. Este modelo fornece aos pesquisadores um modelo reprodutível com que para estudar a regeneração do coração dos mamíferos. Visualização da vasculatura coronária é um componente chave deste método, garantindo a colocação de sutura correta e garantindo assim a reprodutibilidade. Enquanto camundongos adultos não possuem capacidades poiquilotérmicos, a temperatura do corpo e taxa metabólica de ratos neo…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice