Myokardieinfarkt i neonatale mus, en model af Cardiac Regeneration

Summary

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Abstract

Myokardieinfarkt induceret af koronararterie ligering er blevet anvendt i mange dyremodeller som et værktøj til at undersøge mekanismerne af hjertefunktionen opheling og regeneration, og for at definere nye mål for terapeutika. I årtier, modeller af komplette hjerte regenerering eksisterede i padder og fisk, men en pattedyr modstykke var ikke tilgængelig. Den nylige opdagelse af en postnatal vindue hvorunder mus besidder regenerative evner har ført til etableringen af ​​et pattedyrs model af hjerte regenerering. Et kirurgisk model af pattedyr cardiac regeneration i den neonatale mus præsenteres heri. Kort fortalt postnatal dag 1 (P1) mus bedøvet ved isofluran og anbragt på en is pad at inducere hypotermi. Efter brystet er åbnet, og den venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) visualiseres, er en sutur anbragt omkring LAD at påføre myocardial iskæmi i den venstre ventrikel. Den kirurgiske procedure tager 10-15 min. Visualisering kranspulsåren erafgørende for nøjagtig sutur placering og reproducerbarhed. Myokardieinfarkt og hjertedysfunktion bekræftes af triphenyl-tetrazoliumchlorid (TTC) farvning og ekkokardiografi, hhv. Fuldstændig regenerering 21 dage efter myokardieinfarkt verificeres ved histologi. Denne protokol kan bruges som et redskab til at belyse mekanismer pattedyr cardiac regeneration efter myokardieinfarkt.

Introduction

Myokardieinfarkt (MI) er en førende dødsårsag på verdensplan, og er fortsat ansvarlig for omkring en tredjedel af hjertesvigt sager ^1. Mens fremkomsten af ​​perkutan intervention og løbende optimering af anvendelsen af ​​thrombolytiske har øget reperfusion efter MI, cardiomyocyte død og tab af kontraktile myocardium alligevel forekommer. Der er også fortsat et stort antal "no-option" patienter, der ikke er kandidater til eller ikke ser gavn af disse interventioner. Disse patienter fortsætter med at opleve invaliderende iskæmi fører til ardannelse og skadelig ventrikulær remodellering som en mekanisme af infarkt healing. Denne proces i sidste ende resulterer i hjertesvigt, som prognosen fortsat er dårlig trods optimal farmakologisk forvaltning med angiotensin-konverterende enzym (ACE) hæmmere og betablokkere. Desværre, den etårige dødeligheden for patienter med svært nedsat venstre ventrikelfunktion stadig somhøjt som 26% ^2. Hjertetransplantation er den endelige behandlingsmulighed for patienter med hjertesvigt. Men den begrænsede donorbase for hjertetransplantation ikke gøre dette til en farbar vej for de fleste patienter. Således opdagelsen af ​​hidtil ukendte terapeutiske midler til at genoprette den beskadigede myokardium fortsat afgørende til løsningen af ​​hjertesygdom problem. Pålidelige dyremodeller for kardiel skade kræves derfor som et afgørende element i denne proces.

Traditionel dogme har dikteret, at voksne cardiomyocytter er post-mitotiske, terminalt differentierede celler, ude af stand til at opdele eller de-differentierende at udskifte den beskadigede myocardium ^3. Som sådan kunne en voksen pattedyr hjerte aldrig helt komme fra skade, og tabte kardiomyocytter ville blive erstattet med fibrøst væv. Således har forskning fokuseret primært på terapeutiske midler til at minimere infarkt ekspansion og reducere ardannelse. På det seneste har dog et paradigmeskifte opståeti tænkning omkring hjerte-healing og mange forskningsindsats er blevet omdirigeret til at fokusere på potentialet for hjerte-regenerering ^4.

Indtil for nylig var in vivo-undersøgelse af hjertets regenerering begrænset til ikke-hvirveldyr modeller, såsom de i halepadder padder og benfisk ^5-7. Imidlertid har opdagelsen af kapaciteten for cardiac regeneration i neonatale mus førte til udviklingen af to kirurgiske modeller af pattedyr cardiac regeneration: resektion af hjertets toppunkt og koronar okklusion for at inducere myokardieinfarkt ^8,9. I 2011 blev en mus apex resektion model, der anvendes til at vise, at komplet hjerteundersøgelse regenerering findes postnatal dag 1 (P1). Men denne kapacitet falder hurtigt efter den indledende neonatale periode. Den pattedyr hjerte mister sin regenerative potentiale kort efter fødslen på P7 som stamceller numre tilbagegang, og cardiomyocytter bliver binucleated, misterderes proliferative kompetence, og permanent afslutte cellecyklus ^10,11. Forståelse af grundlæggende forskelle mellem den neonatale og voksne pattedyr hjerte kan føre til nye indsigter i hjerte-regenerering.

Mens apex resektion faktisk giver indblik i re-vækst af kontraktile væv, er modellen ikke simulere typiske menneskelige hjerte-skade, og derfor egner sig ikke så godt til udviklingen af ​​lægemidler. Den kranspulsåren okklusion model, men simulerer mere direkte de patofysiologiske aspekter af MI patologi, og dermed kan give mere nyttig indsigt i mekanismer, der kan være gældende for terapeutisk avancement til human brug.

Kirurgisk koronar ligering er blevet anvendt som en nyttig eksperimentel teknik i mange dyremodeller ^12-14. I den voksne kranspulsåreombinding model, er dyrene bedøvet og intuberet for at tillade åbning af brysthulen og samtidig opretholde respiratipå. Hjertet fortsætter med at slå regelmæssigt, hvilket tillader visualisering af den koronare vaskulatur og giver mulighed for nøjagtig sutur placering. Endvidere hjertet forbliver lyserød som perfusion fortsætter, og efter ligering det iskæmiske myocardium forekommer bleg, hvilket indikerer vellykket kranspulsåreombinding. Beskrevet for neonatale mus protokol, imidlertid mindre pålidelig som koronararterien ikke visualiseres og kirurgen skal vurdere, hvor at placere suturen ^15. Selv om den generelle anatomi koronar vaskulatur er den samme, enkelte dyr variabilitet i retning og forgrening af LAD eksisterer ^16. Således når "går i blinde," arterien kunne let savnet. Andre teknikker såsom ekkokardiografi er det dernæst nødvendigt at bekræfte vellykket induktion af MI, og for at sikre alle operationer resultere i en lignende infarktstørrelse. Beskrevet her er en forbedring på en nyligt offentliggjort metode ^15, hvor positionen af LAD kan etableret og således LAD ligeres til reproducerbart inducere MI.

Denne teknik kræver ikke endotracheal intubation eller mekanisk ventilation, som thoracotomi i en underafkølet tilstand i den neonatale mus ikke resulterer i lunge sammenbrud. Men på den tidligere beskrevne fremgangsmåde, alvorlig hypotermi skal induceres til punktet af både komplette apnø og ophør af hjerterytmen ^15. Den største begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at den koronararterie ikke længere er perfunderet og hjertet forekommer bleg selv før LAD underbinding. I tilgangen beskrevet heri, koronar visualisering er mulig på et punkt af sløvhed før dyb hypotermi og hjerterytme ophør, med fuld tilbagebetaling af den neonatale mus efter operationen. Denne metode giver en væsentlig fordel ved 100% reproducerbarhed.

Protocol

Ynglende C57BL / 6 og CD-1 IG-S-mus blev indkøbt fra Charles River. Dyr anvendt i denne undersøgelse blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske Rådet om Animal Care, og studere protokoller blev godkendt af Animal Brug underudvalget ved Western University, London, Canada. 1. Animal Care Efter fødslen er komplet og hvalpe har været oprindeligt ammet af deres mor til et par timer, placere dem i en anden bur med en CD-1 plejemor. CD-1 mødre vise en…

Representative Results

Den myokardieinfarkt procedure P1 kan være afsluttet i 10 – 15 minutter og har en dødelighed på 7,8% (5 ud af 64 hvalpe). Efter operationen, mus komme sig hypotermiske anæstesi inden af ​​5 – 20 min (tid for helbredelse afhænger af kropstemperatur nået under anæstesi og hastighed kirurg). Ved brug af P7 unger (til sammenligning med en ikke-regenerativ myokardiet), er en længere periode med køling kræves for at nå sløvhed. P7 pups er meget større og har sværere genoprett…

Discussion

Den kirurgiske LAD underbinding demonstreret heri er en pålidelig metode til at producere MI i neonatale mus. Denne model giver forskere med en reproducerbar model med at studere pattedyr hjerte regenerering. Visualisering af koronar vaskulatur er et centralt element i denne metode, som sikrer korrekt sutur placering og således sikre reproducerbarhed. Mens voksne mus ikke besidder poikilothermic kapaciteter, er kropstemperaturen og stofskifte af neonatale mus tæt forbundet med den omgivende temperatur. Desuden den li…

Materials

8-0 Nylon Suture	Microsurgery Instruments	8-0 Nylon
11-0 Nylon Suture	Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd	H1101
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-09
Small forceps	Fine Science Tools	11063-07
Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02
Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope	Zeiss	300002
Isoflurane	Baxter	CA2L9100
Isoflurane Chamber	Made in Feng laboratory
Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)	Sigma	T8877
Stereomicroscope SteREO Discovery. V8	Zeiss	435400
AxioVision 8.0	Zeiss
Axiocam Icc5	Zeiss	426554
Heat pad	Sunbeam	731A0-CN
Sterile Gloves	VWR	414004-430
Gauze Sponges	Ducare	90212
Ice