בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות
Summary
אנו מציגים טכניקות פשוטות לבידוד הכרומוזומים lampbrush פעיל תעתיק ענק לחיות ביציות של צפרדעים סלמנדרות. בהמשך נתאר כיצד להתבונן הכרומוזומים הללו "חי" על ידי בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת, וכיצד לתקן אותם ניאון הכלאה באתרו או מכתים immunofluorescent.
Abstract
אנו מתארים שיטות ללימוד הכרומוזומים lampbrush הפעילים הענקים תעתיק (LBCs) נמצאים הביצית, או ביצה תאבה מין, צפרדעים וסלמנדרות. LBCs פרט יכול להיות עד 1 מ"מ אורך והם מתגוררים גרעין ענק, עצמו עד 0.5 מ"מ קוטר. גודלו של הכרומוזומים מתיר תצפיות ללא תחרות של גנים פעילים ידי מיקרוסקופיה אופטית האור, אבל בעת ובעונה אחת טכניקות מיוחדות נדרשים לבידוד הגרעין, הסרת מעטפת הגרעין, והפצת הכרומוזומים בשקופית מיקרוסקופ. גרעין הביצית, הנקרא גם השלפוחית הנבטיה (GV), מבודד מדיום המאפשר gelling החלקית של תקטין הגרעיני ושמר את המבנה העדין של LBCs. שלב זה מתבצע באופן ידני תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים של צורף. בשלב הבא, מעטפת הגרעין מוסר, שוב באופן ידני עם מלקחיים של צורף. תכני הגרעין מועברים במהירות מדיום disperses הג'ל יקטין ומאפשר LBCs הניזוק להתיישב לשקופית מיקרוסקופ. בשלב זה LBCs האברונים גרעיניים אחרים ניתן לצפות על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה התערבות הפרש לעומת זאת, אם כי פרטים עדינים מטושטשים על ידי תנועה בראונית. להסתכלות Microscopical ברזולוציה גבוהה או ניתוח מולקולרי, הכנת כולו centrifuged לצרף את LBCs עדין בתוקף לשקופית. קיבעון קצר paraformaldehyde לאחר מכן על ידי מכתים immunofluorescent או הכלאה באתרו. LBCs נמצא במצב תעתיק פעיל הגודל העצום שלהם מאפשר ניתוח מולקולרי ברמת הגן הבודדה באמצעות confocal או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר.
Introduction
רוב בעלי החוליות, למעט, יש לציין של חיות כיס ויונקי שליה, לייצר ביציות yolky גדולות. למרות גודלם לפעמים עצום, ביצים אלה הם תאים בודדים שמגיעים מימד הסופי שלהם ועדיין בשחלה של הנקבה. ביצי השחלות נקראות ביציות וכל בדרך כלל בנוי מגרעין ענק יחיד, ידוע מאז 19 בתחילת המאה ה כמו השלפוחית הנבטיה או פשוט GV. 1 ביציות צפרדעי המעבדה המשותפות, laevis Xenopus ו tropicalis Xenopus, להגיע בקוטר מקסימאלי של 1.2 מ"מ ו 0.8 מ"מ בהתאמה (איור 1). Gvs מ ביציות בוגרות של שתי צפרדעים אלה הם 0.3 – 0.4 מ"מ קוטר (איורים 2, 3). סלמנדרות בדרך כלל יש גם ביציות גדולות Gvs. מלא ביציות בוגרות של אקסולוטל המקסיקני, Ambystoma mexicanum, יותר מ -2 מ"מ קוטר ואת GV היא כ 0.5 מ"מ. לפיכך, גרעינים אלה גלויים בקלות בעין בלתי מזוינת פחיתלטפל בדרכים רבות כי הם בלתי אפשריים עם הגרעינים של תאי סומטיים טיפוסיים.
לא פחות מדהים הוא בגודל הענק של הכרומוזומים בתוך GV, עובדה המוכרת כבר בסוף המאה ה -19. כרומוזומים בודדים של Ambystoma וסלמנדרות אחרות יכולים להיות עד 1 מ"מ האורך (איורים 4, 5). אלה של Xenopus הם ניכרים קטנים, אם כי עם אורכים עד 100 מיקרומטר או יותר, הם מגמדים את הכרומוזומים סומטיים הטיפוסיים של רוב האורגניזמים. תכונה חשובה של כרומוזומים ביצית היא פעילות התעתיק יוצאת הדופן שלהם, מה שמוביל לאחת תכונות המורפולוגיות האופייניות להם – מאות לולאות לרוחב לזווג (איור 5). לולאה כל מורכב אחד או כמה יחידות שעתוק כי פעיל לסנתז RNA. הלולאות לתת ביצית הכרומוזומים מראה מטושטש, מה שהוביל את השם "lampbrush" כרומוזום לאחר השטחי שלהםדמיון המברשות בשימוש בתקופות קודמות לנקות ארובות מנורת נפט. 2
ההתמקדות של מאמר זה היא על השימוש Gvs מבודד ללמוד LBCs האברונים גרעיניים (nucleoli, גופי מוקד היסטון, ואת כתמים). שני די טכניקות שונות יתוארו. בחלק הראשון, הטכניקה הנפוצה יותר, Gvs מבודד בתוך תמיסת מלח באמצעות המלקחיים של צורף, שטוף בקצרה להסיר חלמון חסיד, ואת מעטפת הגרעין מוסרת, שוב עם המלקחיים של צורף. התכנים הדביקים, המכילים את LBCs האברונים גרעיניים, מותר להתיישב לשקופית מיקרוסקופ זכוכית או coverslip. הכנות כזה ניתן לבדוק באופן ישיר על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה DIC. לחלופין, ההכנות ניתן centrifuged לצרף את LBCs האברונים לשקופית או coverslip. הכנות כזה יכול להיות מעובד מכן לניתוח מולקולרי מפורט של חומצות גרעין וחלבונים, בעיקר על ידי immunofluorescence ו fluorescent הכלאה באתרו (FISH). 3-7
טכניקה שנייה כרוכה בידוד של GV בשמן מינרלים. 8 Gvs-מבודד שמן נשאר פעיל תעתיק במשך שעות רבות מועיל פוטנציאלי עבור מחקרים שבם אחד לא רוצה את התוכן הגרעיני להיות מציאותי ככל האפשר. 9,10 בגלל מקדם השבירה של "מוהל" הגרעין קרובה לזו של LBCs האברונים גרעיניים אחרים (איור 3), טכניקות Microscopical יכול להיות אתגר עם Gvs שמן-מבודד.
לבסוף, בגלל הגודל וקל מניפולציה שלהם, Gvs הוא חומר אידיאלי עבור מחקרים על מעטפת הגרעין. המתחם הנקבובי הגרעין תואר לראשונה ממחקרים מיקרוסקופים אלקטרונים על מעטפות GV דוחות 11 ותצפיות superresolution אחרונות יותר השתמש באותו חומר. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
התצפית הראשונה של LBCs "החיים" מתוך Gvs מבודדים יד של צפרדעים וסלמנדרות נעשו לפני כמעט 80 שנה על ידי הביולוג האמריקני ויליאם Duryee, 19 לפני כניסתה של בניגוד שלב מיקרוסקופיה DIC, לפני immunostaining פלורסנט, ולפני FISH. היתרונות של LBCs לחקירת פרטים של מבנה הכרומוזום שעתוק על הפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
