Isolering av Giant lampbrush kromosomer från Living oocyter av grodor och salamandrar
Summary
Vi presenterar enkla tekniker för att isolera jättetranskription aktiva lampbrush kromosomer från levande oocyter av grodor och salamandrar. Vi beskriver hur man följa dessa kromosomer "levande" av faskontrast eller differentiell interferenskontrast, och hur man rättar dem för fluorescent in situ hybridisering eller immunofluorescerande färgning.
Abstract
Vi beskriver metoder för att studera den gigantiska transkription aktiva lampbrush kromosomer (LBC) finns i äggcellen, eller unlaid ägg, grodor och salamandrar. Enskilda LBC kan vara upp till 1 mm i längd och de bor i en gigantisk kärnan själv upp till 0,5 mm i diameter. Den stora storleken på kromosomerna medger motstycke observationer av aktiva gener genom ljus optisk mikroskopi, men på samma gång speciella tekniker erfordras för att isolera kärnan, avlägsna kärnhöljet, och sprida kromosomerna på ett objektglas. Äggcellen nucleus, även kallad den germinala vesikeln (GV), isoleras i ett medium som tillåter partiell gelning av den nukleära aktin och bevarar den ömtåliga strukturen av LBC. Detta steg utförs manuellt under ett dissektionsmikroskop med användning av guldsmeder pincett. Därefter kärnhöljet avlägsnas, återigen manuellt med jeveleraraffärer pincett. De nukleära innehållet snabbt överföras till ett medium som disperses aktin gelen och tillåter de oskadade LBC sedimentera på ett objektglas. Vid denna punkt LBC och andra kärnorgan kan ses av faskontrast eller differentiell interferenskontrast mikroskopi, även om finare detaljer skyms av Brownsk rörelse. För hög upplösning mikroskopisk observation eller molekylär analys är hela beredningen centrifuger att fästa den känsliga LBC fast bilden. En kort fixering i paraformaldehyd följs sedan av immunofluorescerande färgning eller in situ hybridisering. LBC är i ett transkription aktivt tillstånd och deras enorma storlek medger molekylär analys på individ gennivå med hjälp av konfokal eller super-upplösning mikroskopi.
Introduction
De flesta ryggradsdjur, med det anmärkningsvärda undantaget av pungdjur och moderkakan däggdjur, producerar stora yolky ägg. Trots deras ibland enorma storlek, dessa ägg är enstaka celler som når sin slutliga dimension samtidigt i äggstocken av den kvinnliga. Äggstocks ägg kallas ägg och var och en innehåller vanligtvis en enda gigantisk kärna, känd sedan början av 19-talet som germinala vesikeln eller helt enkelt GV. 1 Oocyter av den gemensamma laboratorie grodor, Xenopus laevis och Xenopus tropic, nå en maximal diameter på 1,2 mm och 0,8 mm respektive (Figur 1). De GVS från mogna oocyter från dessa två grodor är 0,3 – 0,4 mm i diameter (fig 2, 3). Salamandrar har typiskt ännu större oocyter och GVS. Fullt mogna ägg i den mexikanska axolotl, Ambystoma mexicanum, är mer än 2 mm i diameter och GV är ca 0,5 mm. Således är dessa kärnor är lätt synliga för blotta ögat och kanmanipuleras på många sätt som är omöjligt med kärnorna hos typiska somatiska celler.
Lika anmärkningsvärt är den gigantiska storlek kromosomerna inom GV, ett faktum redan erkänt i slutet av 19-talet. Individuella kromosomerna hos Ambystoma och andra salamandrar kan vara upp till 1 mm i längd (Figurerna 4, 5). De av Xenopus är betydligt mindre, men med längder upp till 100 pm eller mer, de dvärg typiska somatiska kromosomer de flesta organismer. Ett viktigt inslag i äggcell kromosomer är deras extraordinära transkriptionsaktivitet, vilket leder till en av sina mest karakteristiska morfologiska egenskaper – hundratals parade sido slingor (Figur 5). Varje slinga består av en eller ett fåtal transkriptionsenheter som aktivt syntetiserar RNA. Slingorna ger äggcellen kromosomer en suddig utseende, vilket ledde till namnet "lampbrush" kromosom efter deras ytligalikhet med de borstar som används i äldre tider för att rengöra fotogenlampa skorstenar. 2
Fokus i denna uppsats är om användningen av isolerade GVS att studera LBC och kärnorgan (nukleolerna, histon locus organ och prickar). Två ganska olika tekniker kommer att beskrivas. I den första, mer vanlig teknik, är GVS isoleras i en koksaltlösning med användning av jeveleraraffärer pincett, i korthet sköljdes för att avlägsna vidhäftande äggula, och kärnhöljet avlägsnas, återigen med jeveleraraffärer pincett. De gelatin innehåll, innehåller LBC och kärnorgan, får sedimentera på en glasobjektglas eller täck. Sådana preparat kan undersökas direkt genom faskontrast eller DIC mikroskopi. Alternativt kan beredningar centrifugeras för att fästa LBC och organeller till bilden eller täck. Sådana preparat kan sedan bearbetas för detaljerad molekylär analys av nukleinsyror och proteiner, främst genom immunofluorescens och fluorescent in situ-hybridisering (FISH). 3-7
En andra teknik innefattar isolering av GV i mineralolja. 8 Olje isolerade GVS förblir transkriptionellt aktiv i många timmar och är potentiellt användbara för studier där man vill kärn innehållet att vara så naturtrogen som möjligt. 9,10 Eftersom brytningsindex för den nukleära "sav" är nära den för de-LBC och andra kärnorganeller (Figur 3), kan mikroskopiska tekniker vara en utmaning med olje isolerade GVS.
Slutligen, på grund av sin storlek och enkel hantering, GSV är idealiskt material för studier på kärnhöljet. Den kärnpor komplex beskrevs först från elektronmikroskopstudier på amfibie GV kuvert 11 och nyare Superresolution observationer har använt samma material. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
De första observationerna av "levande" LBC från hand isolerade GVS av grodor och salamandrar gjordes nästan 80 år sedan av den amerikanska biologen William Duryee, 19 före införandet av faskontrast och DIC mikroskopi, innan fluorescerande immunfärgning, och innan FISH. Fördelarna med LBC för att undersöka uppgifter om kromosomstrukturen och transkription på individuell gennivå krävs utveckling av tekniker för att fästa LBC till objektglas, för att fixera dem på ett verklighetstroget…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
