Isolierung von Riesen Lampbrush Chromosome von Living Oozyten von Fröschen und Salamandern
Summary
Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen "lebendig" durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in – situ – Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben.
Abstract
Wir beschreiben Methoden für die riesigen transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen studieren (LBCS) in der Eizelle gefunden, oder unlaid Ei, von Fröschen und Salamandern. Einzelne LBCS kann bis zu 1 mm lang sein und sie befinden sich in einem gigantischen Kern, selbst mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die große Größe der Chromosomen ermöglicht unvergleichliche Beobachtungen von aktiven Genen, die durch Licht optische Mikroskopie, aber zugleich werden spezielle Techniken zur Isolierung des Kerns, das Entfernen der Kernhülle erforderlich, und die Chromosomen auf einem Objektträger verteilen. Die Eizelle Kern auch die Keimbläschen (GV) genannt wird, wird in einem Medium isoliert, die teilweise Gelieren des nuklearen Aktin ermöglicht und bewahrt die empfindliche Struktur der LBCS. Dieser Schritt erfolgt manuell unter einem Binokular Juwelier Pinzette. Als nächstes wird die Kernhülle, wieder manuell mit Juwelier einer Pinzette entfernt. Die Kerninhalte werden schnell auf ein Medium überführt, die dispeRSES das Aktin-Gel und ermöglicht es, die unbeschädigte LBCS auf einen Objektträger zu begleichen. An diesem Punkt die LBCS und andere Kernorganellen kann durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrastmikroskopie betrachtet werden, obwohl feinere Details durch die Brownsche Bewegung verdeckt sind. Für hochauflösende mikroskopische Beobachtung oder molekulare Analyse wird die gesamte Zubereitung die empfindlichen LBCS fest an der Folie zu befestigen zentrifugiert. Eine kurze Fixierung in Paraformaldehyd wird dann durch Immunfluoreszenzfärbung oder in situ – Hybridisierung verfolgt. LBCS sind in einem transkriptionell aktiven Zustand und ihre enorme Größe ermöglicht auf der individuellen Genniveau molekulare Analyse mittels konfokaler oder superauflösende Mikroskopie.
Introduction
Die meisten Wirbeltiere, mit der bemerkenswerten Ausnahme von Beuteltiere und Plazentatiere, produzieren große yolky Eier. Trotz ihrer zum Teil enorme Größe sind diese Eier einzelne Zellen, die ihre endgültige Dimension erreichen, während noch im Ovar der weiblichen. Ovarian Eier werden Eizellen genannt und jedes enthält typischerweise einen einzigen riesigen Kern, seit dem Anfang des 19. Jahrhunderts als Keimbläschen bekannt oder einfach GV. 1 Oozyten der gemeinsamen Labor Frösche, Xenopus laevis und Xenopus tropicalis, einen maximalen Durchmesser von 1,2 mm und 0,8 mm bzw. (Abbildung 1) erreichen. Die GVs von reifen Eizellen dieser beiden Frösche sind 0,3-0,4 mm Durchmesser (2, 3). Molche haben in der Regel noch größere Eizellen und GVs. Völlig reife Eizellen des mexikanischen Axolotl Ambystoma mexicanum, sind mehr als 2 mm im Durchmesser und der GV ist etwa 0,5 mm. Somit sind diese Kerne gut sichtbar für das bloße Auge und kannwerden in vielfältiger Weise manipuliert, die mit den Kernen der typischen somatischen Zellen unmöglich sind.
Ebenso bemerkenswert ist die gigantische Größe der Chromosomen innerhalb der GV, was sich bereits am Ende des 19. Jahrhunderts anerkannt. Einzelnen Chromosomen von Ambystoma und andere Molche kann bis zu 1 mm in der Länge (4, 5) liegen. Diejenigen von Xenopus sind beträchtlich kleiner ist , wenn auch mit Längen bis zu 100 & mgr; m oder mehr ist , sie die typischen somatische Chromosomen der meisten Organismen dwarf. Ein wichtiges Merkmal der Eizelle Chromosomen ist ihre außergewöhnliche Transkriptionsaktivität, die auf einer ihrer charakteristischen morphologischen Merkmale führt – Hunderte von paarigen seitlichen Schleifen (Abbildung 5). Jede Schleife besteht aus einem oder wenigen Transkriptionseinheiten, die aktiv RNA synthetisieren. Die Schleifen geben Eizelle Chromosomen einer Fuzzy-Auftritt, der auf den Namen "Lampbrush" Chromosom führte nach ihrer oberflächlichenÄhnlichkeit mit den in früheren Zeiten verwendet Bürsten Petroleumlampe Schornsteine zu reinigen. 2
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von isolierten GVs LBCS und Kernorganellen (Kernkörperchen, Histon-Locus Körper und Sprenkel) zu studieren. Zwei ziemlich unterschiedliche Techniken beschrieben werden. In der ersten, häufiger Technik, GVs werden in einer Salzlösung unter Verwendung von Juwelier Zange isoliert, kurz adhärenten Eigelb zu entfernen, gespült und der Kernhülle entfernt wurde, wieder mit Juwelier Zange. Die gallertartiger Inhalte, die LBCS und Kernorganellen enthält, dürfen sich auf einen Glasobjektträger oder Deckglas zu begleichen. Solche Präparate können direkt durch Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie untersucht werden. Alternativ zentrifugiert werden können Zubereitungen, die die LBCS und Organellen mit dem Schlitten oder Deckglas zu befestigen. Solche Präparate können dann für detaillierte molekulare Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen verarbeitet werden, in erster Linie durch Immunofluoreszenz und fluorescent in situ – Hybridisierung (FISH). 3-7
Eine zweite Technik beinhaltet die Isolierung des GV in Mineralöl. 8 Öl isoliert GVs bleiben transcriptionsaktive für viele Stunden und sind potentiell nützlich für Studien , in denen man will , dass die Kerninhalte möglichst naturgetreu zu sein. 9,10 Da der Brechungsindex des Kern "Saft" zu der der LBCS Nähe und andere Kernorganellen (Abbildung 3) kann mikroskopischer Techniken eine Herausforderung mit öl isoliert GVs sein.
Schließlich aufgrund ihrer Größe und Leichtigkeit der Manipulation, GVs sind ideale Material für Studien über die Kernhülle. Die Kernporenkomplex wurde zuerst aus elektronenmikroskopische Untersuchungen an Amphibien GV Umschläge 11 und neueren Hochauflösungs – Beobachtungen haben das gleiche Material verwendet , beschrieben. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ersten Beobachtungen von "lebenden" LBCS von Hand isoliert GVs von Fröschen und Salamandern wurden durch die amerikanische Biologe William Duryee, 19 vor fast 80 Jahren vor der Einführung der Phasenkontrast und DIC – Mikroskopie vor Fluoreszenzimmunfärbung und vor FISH. Die Vorteile von LBCS für Details von Chromosomenstruktur und Transkription auf der individuellen Gen-Ebene erforderlich Entwicklung von Techniken der Untersuchung der LBCS auf Glasobjektträger zu befestigen, sie in einer na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
