Kurbağalar ve Salamanderler Yaşayan Oositlerinin Dev Lampbrush Kromozomların İzolasyonu
Summary
Biz kurbağa ve semender ve oosit yaşayan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozomları izole etmek için basit teknikleri sunuyoruz. Biz faz kontrast ya da diferansiyel girişim kontrast ve nasıl situ hibridizasyon veya immunofluorescent boyama floresan için bunları düzeltmek için tarafından "canlı" bu kromozom gözlemlemek açıklanmıştır.
Abstract
Biz kurbağa ve semender ve oosit ya da unlaid yumurta, bulunan dev transkripsiyonel olarak aktif lampbrush kromozom (LBCs) çalışmak için yöntemler açıklanmaktadır. Bağımsız LBCs uzunluğu en fazla 1 mm olabilir ve çapı 0.5 mm, dev bir çekirdekte kendisini bulunur. kromozomların büyük boyutlu ışık optik mikroskop ile aktif genlerin eşsiz gözlemleri izin, ama aynı zamanda özel teknikler, çekirdeğin izole nükleer zarfı kaldırarak ve bir mikroskop lamı üzerine kromozom yaymak için gereklidir. Ayrıca, germinal vesicle (GV) olarak adlandırılan oosit çekirdeği, çekirdek aktin kısmi jelleşme izin verir ve LBCs hassas yapısını koruyan bir ortamda izole edilir. Bu adım kuyumcuya forseps kullanarak bir mikroskop altında elle yapılır. Sonraki nükleer zarf kuyumcu forseps ile tekrar el kaldırılır. çekirdek içindeki hızlı bir şekilde dağılma, bir ortama transfer ediliraktin jel RBDÖ ve hasarsız LBCs bir mikroskop lamı üzerine yerleşmek için izin verir. ince ayrıntılar Brown hareketi tarafından gizlenmiş olmasına rağmen bu noktada LBCs ve diğer nükleer organeller, faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile görülebilir. yüksek çözünürlüklü mikroskobik gözlem veya moleküler analiz için, tüm hazırlık slayt sıkıca hassas LBCs takmak için santrifüj edilir. Paraformaldehid kısa tespit sonra immunofluorescent boyama ya da in situ hibridizasyon takip edilir. LBCs bir transkripsiyonel olarak aktif durumda olan ve onların büyük boy konfokal ya da süper çözünürlük mikroskopi kullanılarak bireysel gen düzeyinde moleküler analiz izin verir.
Introduction
Çoğu omurgalıların, keseliler ve plasentalı memelilerin önemli hariç, büyük yolky yumurta üretmek. onların bazen muazzam boyutlarına rağmen, bu yumurtalar dişi yumurtalıkta ise hala nihai bir boyut ulaşmak tek hücrelerdir. Yumurtalık yumurta oosit denir ve her biri tipik sadece germinal vezikül veya GV gibi erken 19. yüzyıldan beri bilinen tek ve dev bir çekirdeğe içerir. Ortak laboratuvar kurbağalar, Xenopus laevis ve Xenopus tropicalis 1 Oositler, 1.2 mm ve 0.8 mm sırasıyla (Şekil 1) bir maksimal çapı ulaşır. Çapı 0.4 mm (Şekil 2, 3) – Bu iki kurbağa olgun oosit gelen GV 0.3 vardır. Salamanders genellikle daha büyük oosit ve GVS var. Meksika Axolotl, Ambystoma mexicanum Tamamen olgun oosit, çapı en fazla 2 mm ve GV 0.5 mm'dir. Bu durumda, bu çekirdekler çıplak göz ve kutu kolaylıkla görebilirTipik somatik hücre çekirdekleri ile imkansız birçok yönden manipüle edilebilir.
Eşit olağanüstü GV, 19. yüzyılın sonunda zaten tanınan bir gerçeği içinde kromozomların dev boyutudur. Ambystoma ve diğer semender Bireysel kromozom uzunluğu en fazla 1 mm (Şekil 4, 5) olabilir. 100 um veya daha fazla uzunluğa sahip, en organizmaların normal somatik kromozom cüce, ancak Xenopus olanlar, daha küçük önemli bulunmaktadır. Eşleştirilmiş yanal döngüler yüzlerce (Şekil 5) – oosit kromozom önemli bir özelliği onların en karakteristik morfolojik özelliklerinden biri neden olağanüstü transkripsiyonel aktivite vardır. Her döngü aktif RNA sentez, bir ya da bir kaç transkripsiyon birimi içerir. döngüler oosit onların yüzeysel sonra adı "lampbrush" kromozomun yol açan bir bulanık bir görünüm, kromozom vermekgaz lambası bacaları temizlemek için önceki zamanlarda kullanılan fırçalara benzerliği. 2
Bu çalışmanın odak LBCs ve nükleer organelleri (nükleol, histon eğrisi organları ve benekleri) incelemek için izole GVs kullanımı üzerindedir. İki oldukça farklı teknikler tarif edilecektir. İlk olarak, daha yaygın teknikte, GVs kısa yapışık sarısı uzaklaştırılması için yıkanır, takı forseps kullanılarak bir tuzlu su çözeltisi içinde izole edilmiştir ve çekirdek zarı takı forseps ile tekrar çıkartılır. LBCs ve nükleer organelleri içeren jelatinli içeriği, bir cam mikroskop lamı veya lamel üzerine yerleşmek için izin verilir. Bu gibi terkipler, faz kontrastı ya da DIC mikroskop ile doğrudan incelenebilir. Seçenek olarak ise, preparatlar slayt veya lamel LBCs ve organeller takmak için santrifüj olabilir. Bu gibi preparasyonlar, başta, bağışıklık ve flüoresan olarak, nükleik asitlerin ve proteinlerin ayrıntılı moleküler analiz için işlenebilirin situ hibridizasyon (FISH) t. 3-7
İkinci bir teknik, mineral yağ içinde GV izole edilmesini gerektirmektedir. 8 Yağ izole GVs saatlerce transkripsiyonal olarak aktif kalır ve bir çekirdek içindeki mümkün olduğu kadar gerçekçi olmasını isteyen çalışmalar için potansiyel olarak yararlıdır. Nükleer "sap" kırılma indeksi LBCs ve diğer nükleer organellerin (Şekil 3) birbirine çok yakın olduğu için 9,10, mikroskobik teknikler yağ izole GVs ile bir sorun olabilir.
Son olarak, çünkü boyutu ve manipülasyon kolaylığı, GVs çekirdek zarfına ilgili çalışmalar için ideal bir malzemedir. Nükleer gözenek kompleksi ilk amfibi GV zarf 11 ve daha yeni superresolution gözlemlere elektron mikroskobik çalışmalar açıklanan aynı malzemeyi kullandık. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Kurbağalar ve salamanders el-izole GVs gelen "yaşam" LBCs ilk gözlemler floresan immün önce ve FISH önce, Amerikan biyolog William Duryee, faz kontrast ve DIC mikroskopi giriş önce 19 tarafından yaklaşık 80 yıl önce yapılmıştır. gerçekçi bir şekilde bunları düzeltmek için, ve temel morfolojisi bozmadan moleküler teknikler uygulamak için, cam slaytlar LBCs takmak için teknikler bireysel gen düzeyinde gerekli gelişimini kromozom yapısı ve transkripsiyon detaylarını ara?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
