Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em> vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
El aislamiento del virus gigantes es de gran interés en esta nueva era de la virología, sobre todo porque estos virus gigantes están relacionadas con los protistas. virus gigantes pueden ser potencialmente patógenos para muchas especies de protistas. Pertenecen al orden descrito recientemente de Megavirales. El nuevo linaje Faustovirus que se ha aislado de muestras de aguas residuales está lejanamente relacionado con el virus de la peste porcina africana patógeno de mamífero. Este virus también es específico de su huésped amebas, vermiformis Vermamoeba, un protista común en los sistemas de agua para el cuidado de la salud. Es fundamental seguir aislando nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar su colección genotipo y estudiar su pan-genoma. Hemos desarrollado nuevas estrategias para el aislamiento de cepas adicionales mediante la mejora de la utilización de combinaciones de antibióticos y antifúngicos con el fin de evitar contaminaciones bacterianas y fúngicas de la ameba co-cultivo y favoreciendo la multiplicación del virus. También hemos implementado un nuevo starvation medio para mantener V. vermiformis en condiciones óptimas para el virus de co-cultivo. Por último, se utilizó citometría de flujo en lugar de la observación microscópica, que consume mucho tiempo, para detectar el efecto citopatogénico. Se obtuvieron dos aislamientos de muestras de aguas residuales, lo que demuestra la eficacia de este método y ampliando así la recogida de Faustoviruses, para entender mejor su medio ambiente, la especificidad del hospedador y contenido genético.
Introduction
El descubrimiento de virus gigantes, especialmente los que pertenecen a la orden Megavirales, cambió por completo el mundo de los virus en términos de tamaño de partícula y la complejidad del genoma. Los virus se pensaba que ser entidades pequeñas, y el Mimivirus parecieron romper todas las reglas. 1 metagenomic datos sugiere la ubicuidad de los virus gigantes no sólo en el medio ambiente, 2-5, sino también en los seres humanos. 6 Por lo tanto, todavía hay una necesidad para buscar estos virus a gran escala. La diversidad de estos virus gigantes se evaluó mediante el muestreo no sólo una variedad de ambientes acuáticos y sus sedimentos asociados en todo el mundo, 7-11, sino también por la selección de una variedad de muestras humanas 12,13 y muestras ambientales. 7,9 Los mimivirus Polyphaga Acanthamoeba fue aislado por co-cultivo usando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Una colección completa de virus gigantes eran entonces tambiénaislado de este alojamiento protista especificado, lo que hizo que la comunidad científica restringir su procedimiento de la investigación y el aislamiento de Acanthamoeba spp. Es evidente que esta dependencia de una sola especie de acogida ha dado lugar a una gran parte de los virus que se pasa por alto. El hecho de que el virus gigante, CroV, se aisló con la gran movilidad roenbergensis protozoos marinos Cafetería, 17,18 demuestra la necesidad de utilizar una gama más amplia de protozoos con el fin de descubrir nuevos linajes o familias de virus gigantes. Reteno et al. Lograron seleccionar otros protozoos como anfitriones celulares que nunca antes se había utilizado, y se aisló el nuevo linaje relacionados con Asfar de virus gigantes (el recién nombrado Faustovirus). 19
En un intento de aislar nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar los miembros de este linaje viral, modificamos nuestros procedimientos de aislamiento y los utilizó para examinar muestras ambientales capaces de cosechar nuevos Faustoviruses. Nosotros entoncesse describe el protocolo completo para caracterizar los nuevos aislados. Se evaluó vermiformis Vermamoeba, el protista de vida libre más común encontrado en los ambientes humanos, 20-22 que ya se utiliza en el aislamiento del primer prototipo Faustovirus E12. 19 Este protista actualmente está siendo el anfitrión-específico para Faustovirus. Sabíamos que ninguno de los virus gigantes conocidos era patógena para esta ameba, porque no hay intentos de cultivar otros virus gigantes en nuestro laboratorio mostraron lisis ameba o el crecimiento viral. Por esta razón, nosotros creemos que V. vermiformis es el mejor y más exclusivo apoyo de células conocidas para aislar nuevos Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
La posibilidad de que Faustovirus podría ser el primer miembro de una nueva familia Megavirales cerca de VPPA se sugirió por primera vez por Reteno et al., 19 pero algunas diferencias todavía se puede distinguir. Parece claro si Faustovirus debe unirse a la familia Asfarviridae o si debería en cambio formar una nueva familia viral putativa. Este problema será necesario estudiar más detalladamente, en particular, una caracterización más completa de su morfología, la gama de huéspedes, ciclo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
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