Selüloz Kağıt Diskler ve Çıplak göz Kolorimetrik İmmüno Onların Uygulamaları antikorların bağlama Kovalent
Summary
In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.
Abstract
Bu rapor, selüloz filtre kağıdı notu 1 No'lu (orta akış filtre kağıdı) diskler ve sınıf sayılı 113 (hızlı akış filtre kağıdı) disklerine yakalama antikorların kovalent immobilizasyonu için iki yöntem sunar. antikorlar, bunların üzerinde hareketsiz önce bu selüloz kağıt diskler bir silan birleştirme tekniği ile amin fonksiyonel grubu ile aşılanmıştır. Periodat oksitleme ve glutaraldehid çapraz bağlama yöntemleri selüloz kağıt diskler üzerinde yakalama antikorları graft için kullanılmıştır. immobilizasyon sonra hedeflere antikorlarla maksimum bağlama kapasitesini sağlamak için, sodyum periodat, glutaraldehid ve kağıt diskler yüzeyi üzerinde antikorlarla çeşitli konsantrasyonlarda etkisi araştırılmıştır. periodat oksitleme yöntemine göre bir glutaraldehid çapraz bağlama maddesi yoluyla amin fonksiyonlu selüloz kağıt diskler üzerinde kaplanmıştır antikorlar hedef bağlanma aktivitesi geliştirilmiş gösterdi. (Fare referans serumda) IgG glutaraldehit yoluyla kovalent olarak hareketsizleştirilmiş antikor uygulamasını test etmek için bu çalışmada referans hedef olarak kullanıldı. Yeni bir kağıt bazlı, enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), başarılı bir şekilde geliştirilmiştir ve IgG saptanması için doğrulanmıştır. Bu yöntem, ekipman gerektirmez ve IgG 100 ng / ml algılayabilir. Hızlı akışlı filtre kağıdı orta akış filtre kağıdı daha duyarlıydı. Bu testin kuluçka süresi kısa ve küçük bir örnek hacimleri gerekli. Bu çıplak gözle, kolorimetrik immunoassay geleneksel ELISA ile tespit edilir diğer hedefleri tespit etmek için uzatılabilir.
Introduction
Nokta-bakım testi (POCT) tanı çalışma tedavi için yeni stratejilerin geliştirilmesi, kişiselleştirilmiş tıp ve ev bakımı 1 için çok önemlidir. Onlar, ucuz erişilebilir ve kullanıcılara 2 tanıdık gibi selüloz kağıtları yaygın bağışıklık platformlarda olarak kullanılır. Buna ek olarak, selüloz kağıt gözenekli yapısı ek enerji etkisi olmadan sıvı akışını sürücü güce sahip. Kağıt tabanlı biyo analizler kayıtları gibi erken en yaygın örneği hamilelik ve diyabet test şeritleri olarak immünokromatografik testleri 3, 1952 yılında kağıt kromatografisi ilk icat edildi 20. yüzyılın olarak bulunabilir. Bu testler nispeten hızlı tahlil süreleri ve ucuz analizi 4 sağlamaktadır. Nedeniyle bunların basitliği, bu geleneksel kağıt şerit testler yaygın POCT teşhis 5 kullanılmıştır.
Kolorimetrik 6, elektro dahil saptama yöntemleriKimyasal 7 ve elektrokemiluminesans 8 Yöntem biyolojik numunelerde hedeflerini ölçmek için rapor edilmiştir. Bu sayısal yöntemlere ek olarak, selüloz kağıt üzerindeki antikorların hareketsiz tutmak için güvenilir bir yöntem, aynı zamanda teşhis cihazları geliştirilmesi için önemlidir. Non-spesifik adsorpsiyon immobilizasyon sonra hedeflerine azami bağlama kapasitesini sağlamak için kağıt tabanlı cihazlar 9, 10 yüzeyindeki antikorların değiştirmek için ana stratejisidir. Ancak, bir önceki çalışma Selüloz kağıt üzerine adsorbe edilir antikorlar% 40 elyaf 11 desorbe göstermiştir. Böylece, selüloz üzerine antikorların direkt adsorpsiyonu tekrarlanabilir sonuçlar 12 sağlayamayabilir. Kağıt yüzeylere aşılanmış antikorların kovalent immobilizasyon etkili bir kağıt bazlı biyo-tahliller 13 gelişmekte olan alternatif bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler selüloz 14, 15 modifikasyonu için bildirilmiştir </sup>. İdeal olarak, antikorlar immobilizasyon 12 sonra kendi özgün işlevlerini korumak gerekir. Karbonildiimidazol 1-siyano-4-dimetilaminopiridinyum tetrafloroborat 16 ile birleştirilir; 18. UV-bazlı aktivasyon strateji 17, 1 ile-floro-2-nitro-4-azidobenzene; ksiloglukan değişiklik 19 dayanan bir chemoenzymatic strateji; bir 1,4-fenilendiizotiyosiyanat bağlayıcı madde 20; heteropolisakarit oksidasyon 21 tıklama kimyası 22; ve katyonik porfirinler 23 kovalent selüloz kağıt üzerinde biyomoleküllerin immobilize etmek için kullanılmıştır. Kitosan modifiye Kağıdı bol ve 27 biyouyumlu olduğu kağıt tabanlı immunodevices 24-26 geliştirmek için kullanılır olmuştur. Kitosan katyonik ve anyonik selüloz 27 kuvvetle yapışır. yakalama antikorları kitosan kaplama ve glutaraldehid çapraz bağlama yoluyla kağıt üzerinde immobilize edilir. Periodat oksitleme Yüzbaşı aşılama için başka bir yöntemdirselüloz kağıdından 28 ure antikorlar. Bu yöntemde, sodyum periodat aldehid gruplarına doğrudan selüloz 1,2-dihidroksi (glikol) gruplarına dönüştürmek için kağıt üzerinde fark edilir. Aldehit grupları daha sonra polisakkaritler ve antikorlar 28 arasında kovalent bağlar oluşturmak için kullanılırlar. imalat basit olmasına rağmen, tamamen, sodyum periodat yıkamak zordur. Yıkanmamış sodyum periodat antikorların etkinliğini ve stabilitesini etkileyen, selüloz kağıt üzerinde immobilize edilir antikorların daha oksidasyona neden olabilir N -. (3-dimetilaminopropil) – etilkarbodiimid hidroklorür ve N-hidroksisukinimid çapraz bağlayıcılar ayrıca kullanılan kovalent nano bazlı deneylerde 29 geliştirilmesi için electrospun poli-L-laktik asit ve selüloz asetat nanoliflerde antikor hareketsiz hale getirir.
Bu çalışmada, bir silan birleştirme tekniği SELÜLOZDEN ilgili amin fonksiyonel grupları graft için kullanılane kağıt diskler. Bu teknik, maksimum dikey akış yoluyla immün sağlayan orijinal gözenek boyutu, esneklik ve selüloz filtre kağıdı filtrasyon hızını korumak için yardımcı olur. silan birleştirme tekniği çok fazla modifikasyonu kullanılarak biyomoleküllerin ardından ikincil amin grubu ile alt-tabaka yüzeyleri işlevselleştirilmesi biyosensör kullanılmıştır. Matris yüzeyinin üzerine amin gruplarının eklenme -OH organofonksiyonel silan maddelerin grupları ve matriks substrat 30 ile bir yoğunlaştırma reaksiyonu ihtiva eder. Selüloz kağıt diskler 3-aminopropihrimetoksisilanı (APS) ile 31 silan bağlama ile amin gruplarıyla beraber çalışan bulundu. Bu iki farklı yöntem kullanarak kovalent hareketsizleştirici antikorlarla izledi. İlk yöntem, bir amin işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler periodat oksidize antikorlarla bağlanması içeriyordu. İkinci yöntem yakalama antibodi takmak için bir çapraz bağlama maddesi olarak glutaraldehid kullanılanamin grubu işlevselleştirilmiş selüloz kağıt diskler es. Yakalama antikorlarının varlığı bir floresan molekül bir görüntü cihazını kullanarak, tavşan anti-insan IgG-floresin izotiyosiyanat (FITC) ile teyit edilmiştir. anti-tavşan IgG keçi, tavşan anti-insan IgG-FITC bağlanma aktivitesi, peroksidaz substrat ile değerlendirildi. sodyum periodat, glutaraldehid ve yakalama çeşitli antikor konsantrasyonları etkileri incelenmiştir. immobilize yakalama antikor uygulama testi başarıyla IgG serum tespiti yoluyla gerçekleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
modifiye edilmemiş selüloz kağıt diskler üzerinde afinite saflaştırması yapılmış keçi anti-fare IgG-Fc yakalama antikoru doğrudan kaplama IgG konsantrasyonları tespit etmek için yapılmıştır. Sonuçlar antikorlarla daha sabitleme tekrarlanabilirliği için gerekli olan, ortaya koymuştur. Silan tekniğin başarılı selüloz kağıt diskler 34 amin fonksiyonel gruplarının eklenmesi için kullanıldı. APS konsantrasyonu antikor hareketsiz hale etkiler. Bu nedenle, aseton içinde APS miktar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Education, Singapore through the Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
Materials
| Cellulose filter paper, Grade1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich, Singapore | T1255 | >96% |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCL | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/mL |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| Image J | RGB, free download | N/A | |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al. Paper-based ELISA. Angew. Chem. 122 (28), 4881-4884 (2010).
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane – a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- . . Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M. Aminosilane-grafted cellulose. BioResourses. 8 (3), 4468-4483 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows’ milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
