Génome Édition dans<em> Astyanax mexicanus</em> Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs)
Summary
la mutagenèse du gène de ciblage est maintenant possible dans une large gamme d'organismes en utilisant des techniques de montage du génome. Ici, nous démontrons un protocole pour la mutagenèse du gène ciblé utilisant l' activateur de la transcription comme nucléases effectrices (Talens) dans Astyanax mexicanus, une espèce de poisson qui comprend les poissons de surface et cavefish.
Abstract
Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.
Introduction
Comprendre la base génétique de l'évolution caractéristique est un objectif de recherche critique des biologistes évolutionnistes. Des progrès considérables ont été accomplis dans l' identification des loci sous – tendent l'évolution des traits et d' identifier des gènes candidats au sein de ces loci (par exemple 1-3). Cependant, le test fonctionnel du rôle de ces gènes est restée difficile que de nombreux organismes utilisés pour l'étude de l'évolution des traits ne sont actuellement pas génétiquement traitable. L'avènement des technologies de l'édition du génome a considérablement augmenté manipulabilité génétique d'un large éventail d'organismes. Transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens) et regroupés régulièrement espacées répétitions courtes palindromiques (de CRISPRs) ont été utilisés pour générer des mutations ciblées dans des gènes dans un certain nombre d'organismes (par exemple 4-11). Ces outils, appliqués à un système évolutionnaire pertinent, ont le potentiel de révolutionner le chemin biologistes évolutionnistes étudier la base génétique de l'évolution.
Astyanax mexicanus est une espèce de poisson qui existe sous deux formes:. Un (poissons de surface) de la rivière-logement sous forme de surface et de multiples formes cavernicoles (de cavefish) A. mexicanus cavefish a évolué à partir d' ancêtres de poissons de surface (revue dans 12). Les populations de poissons cavernicoles ont évolué un certain nombre de traits , y compris la perte d'yeux, de diminuer ou de la perte de la pigmentation, nombre de papilles gustatives et neuromastes crâniens, et les changements accru de comportement tels que la perte du comportement de la scolarité, l' augmentation de l' agressivité, des changements dans l' alimentation posture et hyperphagie 13 -19. Cavefish et les poissons de surface sont interfécondes, et des expériences de cartographie génétique ont été réalisées pour identifier les gènes loci et candidats pour les caractères de la grotte 1,20-26. Certains gènes candidats ont été testés pour un rôle fonctionnel dans la contribution aux caractéristiques des cavernes dans la culture cellulaire 1,19, dans des organismes modèles d'autres espèces 21 ou 27 par une surexpression ou knock – down temporaire uchanter morpholinos 28 A. mexicanus. Cependant, chacune de ces méthodes a des limites. La capacité de générer des alleles mutants de ces gènes chez A. mexicanus est essentiel pour la compréhension de leur fonction dans l'évolution de cavefish. Ainsi, A. mexicanus est un organisme candidat idéal pour l' application des technologies de modification du génome.
Nous présentons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus utilisant TALENs. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la mosaïque injectée fondateur du poisson pour les phénotypes et pour isoler les lignes de poissons avec des mutations stables dans les gènes d'intérêt 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
De grands progrès ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension de la base génétique de l'évolution des traits. Alors que les gènes candidats qui sous – tendent l'évolution d'un certain nombre de traits ont été identifiés, il est resté difficile de tester ces gènes in vivo en raison de l'absence de traçabilité génétique des espèces les plus intéressantes évolutionnaire. Nous rapportons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Département de génétique, de développement et de biologie cellulaire et de l'Iowa State University et par NIH EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner a fourni des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
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