윤충류는 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 동물성 플랑크톤입니다. 여기에서는 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 여러 세대에 걸친 배양 조건의 동기화는 모계 조건이 자손의 생활사에 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다.
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이 논문에서
요약
초록
윤충류는 짧은 수명, 배양의 용이성, 클론 배양을 가능하게 하는 단성형성과 같은 몇 가지 장점으로 인해 생태독성학 및 노화 연구에서 모델로 사용되는 미세한 코스모폴리탄 동물성 플랑크톤입니다. 그러나 생존 시간을 측정할 때는 모계의 나이와 모계의 섭식 조건에 영향을 받기 때문에 주의가 필요합니다. 여기에서는 여러 세대에 걸친 배양 조건의 신중한 동기화에 따라 Brachionus 윤충류의 생존 시간을 강력하고 재현 가능하게 측정할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 경험적으로 볼 때, 동기화가 불량하면 조기 사망률이 발생하고 생존율이 점진적으로 감소하여 통계적 검정력이 약해집니다. 실제로, 이러한 조건 하에서, 칼로리 제한(CR)은 B. plicatilis의 수명을 크게 연장하지 못했지만, 과거와 현재의 연구에서 잘 동기화된 윤충류 샘플로 CR로 유도된 수명이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 초파리 Drosophila melanogaster와 선충 Caenorhabditis elegans를 포함한 다른 무척추 동물 모델에 유용 할 수 있습니다.
서론
로티퍼는 문 Rotifera 1을 구성하는 미세한 국제 동물 플랑크톤 (<1mm)입니다. 이들은 약 1000 체세포과 특성 차륜 형 섬모 장치 이루어지는 간단한 신체 운동 계획 및 공급을 위해 사용되는 코로나라고있다. 대부분의 로티퍼는 약 1,600과 500 종 각각 2를 포함하는 클래스 단 소강 또는 질 형목에 속한다. bdelloid 로티퍼가 의무 처녀 생식 (3)에 의해 재생하는 동안 단 소강 로티퍼는 일반적으로 모두 성적과 무성 생식 단계 (순환 처녀 생식)가 있습니다. 이 실험에서 높은 재현성을 보장 전적으로 동일한 로티퍼 개인을 얻는 것이 가능하다. 또한, 그들은 짧은 수명, 배양 용이성, 게놈과 transcriptomic 4-7 시퀀스 데이터의 가용성, 및로부터 떨어진 독특한 계통 위치로서 모델 생물 여러 다른 장점을 가지고rthropods 및 선충 8. 로티퍼 따라서 생태 학적, 독성의 무척추 동물 모델을 약속하고, 연구 9-12 노화된다.
환경 스트레스 또는 화학 물질에 노출 하에서 생존 시간이 13-19 연구 분야에서 자주 측정 된 파라미터이다. 이 어머니의 환경 조건에 민감하기 때문에....
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프로토콜
미디어의 1. 준비
참고 : 사용에게 염분 16.5 PPT (PSU)의 반 희석 Brujewicz 인공 해수를. 다른 인공 seawaters도 자주 문화 Brachionus의 로티퍼 (25), (26)에 사용된다.
- 454 mM의 염화나트륨을 추가, 26 밀리미터의 MgCl 2, 27 mM의 황산, 10 밀리미터의 KCl, 증류수 10 mM의 CaCl2를 4.5 L은 (최종 부피 5 L 될 것입니다). 또한, 탈 희석 물 대신에 증류수를 사용합니다. 다른 모든 염을 용해 후 CaCl2를 추가합니다.
- 0.48 M의 NaHCO3 원액 (200 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 25 ML을 추가합니다. NaHCO3을 최종 농도가 2.4 mm이다.
- 0.4 M NaBr은 원액 (500 배 농도)를 준비합니다. 상기 용액에 10 ㎖를 추가합니다. NaBr은 최종 농도가 0.8 mm이다. 증류수로 5 L까지합니다.
- 0.45 ㎛ 멤브레인 필터 솔루션 필터.사용하기 전에 그것을 멸균 수로 2 회 희석 (v / v)로.
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결과
그림 1은 제대로 동기화 인구 (두 개의 복제 만점)의 대표적인 생존 곡선을 보여줍니다. 이 실험에서, 로티퍼이었다 중 공급 일상 [광고 무제한 (AL) 그룹] 또는 (그룹 IF) 매일. 평균 생존 기간은 각각 그룹화 AL 및 IF (13) 18 일이었다. 이를 잘 IF는 로티퍼의 수명을 연장하는 것이 알려져 있지만,이 실험은 AL 및 그룹 IF 수명 사이의 유의 한 차이를 검출하지 못했다. 경험적 조기 사망률과 생존율의 점진적인 감소가 불충분 동기화 결과는이 실험에서 관찰했다. 하위 집단에 대한 부적절한 처리 또는 낮은 수질로 인한 로티퍼 손상과 유사한 결과를 얻을하는 경향이있다.
로티퍼 조건이 최적 잘 동기화되면, 조기 사망은 거의 관찰되지 및 accordin된다의 Gly 로티퍼 실험 .......
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토론
현재의 프로토콜 Brachionus 피퍼의 생존 시간을 측정하는 방법을 설명한다. 중요한 단계는 여러 세대에 걸쳐 로티퍼 상태의 동기화이다. 실험 피퍼 잘 동기화되면 여러 선행 연구 18,24,37,38에보고 된 일반적인 유형 I 생존 곡선은 거의 조기 사망이 관찰된다. 생존 시간의 표준 편차 따라서 높은 통계 전력의 결과로 가난하게 동기화 로티퍼에 비해 작아진다. 동기화는 또한 생존 시간 측정의 재현성을 향상 할 것으로 예상된다 - 엄마 최적 조건에서 배양되므로, 현재 프로토콜 모체 세대의 가능한 해로운 효과를 상쇄. 조기 사망률이 여전히 조심 동기화 후 관찰되는 경우, 새로 준비 문화 미디어 사용을 고려, 즉 먹이 조류, 또는 새로 설립 된 실험 집단의 다른 많은 (,) 프로토콜 3.1에서 시작합니다.
이 프로토콜의 제한은 잘 동기화 로티퍼 잠재적 통해 문자를 구분한다는 것입니다. 예를 들어, 수명을 연장.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 촬영에 그들의 도움을, 조지 자비스, 마사 복, 그리고 베티 Hecox - 레아, 해양 생물 연구소에 감사하고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화나트륨 | Wako | 190-13921 | |
| 염화마그네슘 | Wako | 136-03995 | |
| 황산마그네슘 | Wako | 131-00427 | |
| 염화칼 | Wako | 168-22111 | |
| 염화칼슘 | Wako | 035-00455 | |
| 중탄산나트륨 | Wako | 199-05985 | |
| 브롬화나트륨 | Wako | 190-01515 | |
| 멤브레인 필터(0.45 &마이크로; m 기공 크기) | Millipore | HAWP04700 | |
| Culture plate, 6-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D01 | Flat bottom |
| Culture plate, 48-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D07 | Flat bottom |
| Tetraselmis, Living | Carolina Biological Supply Company | 152610 | |
| PRISM 6 | GraphPad Software | Version 6.0d |
참고문헌
- Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
- Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnoli....
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재인쇄 및 허가
