마우스를 모델 시스템으로 사용하여 인간 질병과 관련된 유전자군을 이해하기 위한 역유전학 접근 방식을 제시하고 후속 마우스 표현형 분석 일정을 설명합니다. 관심 유전자인 HtrA2에 결함이 있는 마우스가 파킨슨병 증상을 보였기 때문에 표현형 분석 요법은 신경학적 결함을 식별하는 데 중점을 둡니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
노화와 관련된 질병은 점점 더 널리 퍼지고 있으며 인구가 고령화됨에 따라 부담은 계속 증가하고 있습니다. 쇠약해지는 상태의 영향을 줄이기 위해 효과적인 치료가 필요하지만 많은 경우 여전히 파악하기 어렵습니다. 노화와 관련된 질병의 원인과 병리학을 이해해야만 과학자들은 잠재적인 치료 대상을 식별하고 개입 전략을 개발하기 시작할 수 있습니다. 가장 흔한 노화 관련 질환은 파킨슨병 및 실명과 같은 신경퇴행성 질환입니다. 노화 관련 황반변성(AMD)은 노인 실명의 주요 원인입니다. 게놈 와이드 연관성 연구는 이전에 이 질병에 대한 감수성 증가와 관련된 유전자좌를 확인하고 두 가지 관심 영역, 즉 보체 인자 H(CFH)와 연령 관련 황반병증 감수성 2(ARMS2) 및 고온 요구 인자 A1(HtrA1) 유전자가 위치한 10q26 유전자 자리를 확인했습니다. CFH는 보체계의 대체 경로(AP)의 음성 조절자로 작용하는 반면, HtrA1은 세포외 세린 프로테아제입니다. ARMS2는 영장류 게놈에서 HtrA1의 상류에 위치하지만, 마우스에는 유전자가 없습니다. 이러한 유전자의 영향을 연구하기 위해 Cfh 및 ARMS2의 인간화 넉인 마우스 라인, Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 및 HtrA4의 녹아웃 및 HtrA2의 조건부 신경 결실을 생성했습니다. 모든 유전자 조작 생쥐 중에서 전신 또는 신경 조직에서 HtrA2가 결핍된 생쥐만이 명확한 표현형을 나타냈습니다. 이 쥐를 철저하고 체계적으로 검사하기 위해 두 가지 주요 관심 질병인 AMD와 파킨슨병과 관련된 일련의 테스트로 구성된 초기 표현형 분석 일정이 수립되었습니다. 유전자 변형 마우스는 인간의 관련 질병과 관련될 수 있는 표현형을 확인하기 위해 적절한 실험을 수행할 수 있습니다. 미토콘드리아에 초점을 맞춘 표현형 분석 요법이 관심 테스트의 대표적인 결과와 함께 여기에 제시되어 있습니다.
서론
연령 관련 질환은 현대 사회에서 점점 더 널리되고있다. 의료 과학이 향상되고 평균 수명이 증가함에 따라, 인구는 계속 나이를 이러한 질병의 부담이 커집니다. 효과적인 치료법은 쇠약 조건의 영향을 줄이기 위해 필요하지만, 많은 경우에 어려운 남아있다. 만 원인 및 노화와 관련된 질병의 병리를 이해함으로써 과학자들은 개입 전략을 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개발을 시작할 수 있습니다. 일반적인 노화와 관련된 상태는 파킨슨 병 (PD), 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 신경 퇴행성 장애를 포함한다. PD는 인간의 신경 퇴행에 의한 가장 일반적인 운동 장애이다. 대부분의 PD 환자는 50 세 이후 진전, 운동 완만 및 강성을 휴식 등의 증상을 보여줍니다. 조기 개시는 경우 약 10 %에서 관찰되었다.
AMD는 실명의 주요 원인입니다노인 점진적 감광체 손상 및 눈의 망막 색소 상피 (RPE). 중심 시력이 손상되지만 주변 시력은 일반적으로 영향을받지 않습니다. AMD의 두 가지 형태가있다. "가공"형태에서, RPE와 브루흐의 막 (BM) 사이 드루 젠의 형태로 알려진 세포 외 단백질 예금, 지리적 위축으로 이어지는 중앙 비전의 흐림. 더 심각한 "습식"형태의 망막 색소 상피와 광 수용체 층에 BM에서 맥락막 신생 혈관에서의 결과와는 망막....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 문 : 동물과 관련된 연구는 예일 대학의 실험실 동물의 관리 및 사용과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 건강 권고의 국립 연구소 준수 실시 하였다.
유전자 변형 마우스 1. 행동 테스트
주 : 모든 마우스는 처리에 습관화 차이를 제한하기 위해 동일한 시험 요법을 실시해야한다. 시험 날의 동일한 시간마다 수행되어야한다.
- 신생아 뒷다리 테스트
주 : 뒷다리 시험 근위 뒷다리 근력, 쇠약 및 피로를 평가하기 위하여 생후 P10로 일 (P) 4 매일 수행된다.- 시험 영역으로 전송 마우스는 시험 전에 30 분 동안 휴식을 허용합니다.
- t의 바닥에 두 개 (P4-P8) 또는 1 (P9-P10)면 공을 추진, 70 % 에탄올로 50 ML 원뿔 튜브를 청소하여 시험 장치를 준비우베는 수직 위치에 고정.
- 케이지 기록 무게에서 한 강아지를 제거합니다. 테스트하지 때마다 열 패드 트레이를 들고 강아지를 유지합니다.
- 부드럽게는면 공을 향해 아래로 향하게되도록, 원뿔 튜브의 변죽을 통해 신생아의 뒷다리를 일시 중지합니다. 스톱워치를 사용하여 가을에 만든 풀 시도 및 측정 대기 시간의 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 섹션에서는 이러한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 설명합니다. 뒷 사지 시험에서, 풀 시도 횟수가 이루어지고 지연은 매일 두 개의 연속적인 시험을 통해 합산되어 낙하. .이 시험은 감소 신경근 강도 HtrA2의 tm1jhoh 쥐 구별 전적으로 다른 그룹과 비교하는데 사용될 수있다 (HTRA2 KO)도 1a에 마우스 - B는 P4-6에서 감소 하였다 떨어 구해 지연의 수의 변화가 입증되지 한배 새끼 (HTRA2의 WT)에 비해 P7-10에서 신경 근육 강도입니다. 나이 강도의 예상 증가는 야생형 동물에서 관찰된다. 젖을 갓 뗀 관찰 테스트를 위해 총 활동은, 테스트의 세 연속 일에 걸쳐 평균 (라인 양육 및 이벤트를 정리, 횡단) 모든 이벤트를 합산하여 평가 될 수있다. 또한, 이벤트의 각 특정 유형의 individuall 될 수 있습니다Y는 분석했다. 여기에 대.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
강력한 치료법은 인간의 노화와 관련된 쇠약 상태의 영향을 제한 할 필요가 있지만, 여러 조건을 피하는 유지된다. 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개입 전략을 개발하기 위해, 원인과 노화와 관련된 질병의 병리 먼저 이해해야합니다. 되지 않은 유전자는 이전 연구에서 인간 상태로 연결되어있다하더라도, 관심있는 질병과 관련된 표현형 즉시 분명 존재하는 모든 유전자 변형 마우스. 따라서보다 체계적인 연구가 필요하며, 유전자 변형 마우스는 인간에 관련된 질환과 관련 될 수있다 표현형을 식별하기위한 적절한 실험을 실시한다.
무수한 행동 테스트는 마우스 50, 51의 신경 기능을 분석하기 위해 존재한다. 본원에 설명 된 행동 검사는 인간 결과와 실제의 표현형에 기초하여 상기 가정 된 표현형에 적합한 obse마우스에서 rved. 또한, 이러한 테스트는 행동 실험을 거의 또는 전혀 경험이있는 실험실에서 수행 할 간단합니다. 복잡한 장비가 필요는 없지만, 그 결과는 신경근 결.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구를위한 자금 조달은 진달래 의료 재단과 예일 의과 대학 학장의 연구 기금 (JH)에서왔다. 우리는 행동 실험에 대한 도움말 박사 클레어 코닉 감사합니다. 유전자 조작 마우스 라인 Ozgene (퍼스, 호주)에서 발생 하였다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에탄올 | 디콘 (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50ml 원뿔 튜브 | 피셔 사이언티픽 | 1443222 | |
| 면봉 | 월마 | ||
| 히트 매트 | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| 홀딩 트레이 (아이스 큐브 트레이) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| 에서 제작된 | 플렉시글라스 상자 | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 캠코더 | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz 클리어 컵 | 월마트 | ||
| 1/4 인치 와이어 메시 | 홈 디포 | 204331884 (온라인) / 554219 (매장에서) | 12" by 12" |
| 버블 랩 | VWR | 470092-416 | |
| 스트레이트 시편 집게 | VWR | 82027-438 | |
| 미세 팁 절개 집게 | VWR | 82027-408 | |
| 미세 가위 | VWR | 82027-578 | |
| 파라 포름 알데히드 16 % 용액 | 전자 현미경 과학 | 15710 | |
| 10x 인산염 완충 식염수 pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| 슈퍼프로스트 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 다이소듐 염 수화물 | 시그마 | N8129 | |
| 니트로테트라졸륨 블루 클로라이드 | 시그마 | N6876 | |
| 아세톤 | JT 베이커 | 9006-05 | |
| 인산나트륨 일염기성 일수화물 | 시그마 | S9638 | |
| 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 | Sigma | S9390 | |
| 호박산나트륨 이염기성 육수화물 | Sigma | S2378 | |
| VectaMount 수성 장착 매체 | Vector Labs | H-5501-60 | |
| 커버 유리 | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 현미경 | Zeiss | ||
| 비디오 카메라 삼각대 | 아마존 | ||
| 최적 절단 온도(OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| 저온 유지 절편 기계 | 라이카 | CM1900 | 단종되었으나 CM1950으로 교체되었습니다. |
참고문헌
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
