Method Article

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

DOI:

10.3791/54138

⸱

June 22nd, 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(Treg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, Treg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 REG) 세포, CD4 + T 세포의 서브 세트이다. T의 등록 세포는 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 등록 세포의 주요 역할은 효과기 T (T의 EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T 세포에 등록하는 기능, 마우스 또는 인간 T 등록 세포를 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T 레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T 세포는 등록 나이브 마우스로부터 단리 된 T 세포를 등록 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 등록 된 T 세포 휴식에서 활성화 된 T 세포를 등록 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 등록 세포의 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

규제 T (T의 REG) 세포는 개발 및 기능 1 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 등록 세포는 CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) (3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 (4) 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) (5) 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 6,7, 8,9 박테리아, 기생충 10-12 또는 암 13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 등록 셀은 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 +와 CD8 + T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 등록 세포가 손상된 CD8 + T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 15 ~ 17시 전자. FV 유발 T에 등록 셀은 IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 +....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다.

솔루션 1. 준비

  1. RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비
  2. 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다.
  3. 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다.
  4. T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산.

비장 림프구 2. 분리

  1. 이전 19 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 6 PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 등록 세포 및 만성 바이러스 감염시 T 전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 + T의 전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 - - CD8 + T의 전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T 세포의 레지 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 13,14 세포 증가 REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. 레지 세포 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다.

여기서는 T에 등록 세포의 생체 표현형 분석 및 CD8 + T 세포와 T에 등록 세포의 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 등록 세포의 분리이다. 라이브 갓 절연 T <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.-JH는 특허를 보유하고 있으며 PD-1 경로와 관련된 특허 로열티를 받습니다. 다른 저자들은 재정적 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 교육부 지원(2015R1A6A3A01020610)의 한국연구재단(NRF)의 기초과학연구사업과 대한민국 보건복지가족부 한국보건기술R&D사업(HI15C0493 to SJH)의 지원으로 이루어졌다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FITC 쥐 안티 마우스 CD4RM4-5BD Biosciences553047
Cytofix/CytopermBD Biosciences554714
U-Bottom Tissue Culture PlatesBD Biosciences353077
고정 완충액BD Biosciences554655
FITC 쥐 안티 마우스 CD257D4BD Biosciences553072
세포 여과기, 70 mmBD Biosciences352350
세포 여과기, 40 mmBD Biosciences352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)29F.1A12BioLegend135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4RM4-5Biolegend100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 FJK-16seBioscience17-5773
Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트eBioscience00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a53-6.7eBiosicence45-0081
마우스 IFN-gamma Platinum ELISAeBiosicenceBMS606
RPMI 1640GE Life SciencesSH30027
PBS (1x)GE 생명 과학SH30256
ACK 용해 버퍼GibcoA10492-01
L-글루타민, 200 mM 용액Gibco 25030
페니실린-스트렙토마이신, 10,000 U/mlGibco 제10378-016
LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트Life TechnologiesL-34975
CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스Miltenyibiotec130-104-075
CD4+ CD25+ 조절 T 세포 분리 키트, 마우스Miltenyibiotec130-091-041
MACS 분리 컬럼, LD 컬럼Miltenyibiotec130-042-901
MACS 분리 컬럼, LS 컬럼Miltenyibiotec130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)PromegaV4231
2-MercaptoethanolSigma Life ScienceM7522
소 태아 혈청Thermo Fisher ScientificSH30919.03
CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트Thermo Fisher ScientificC34557
BD Canto II 유세포계BD Biosciences
FlowjoTreeStar
혈구분석기Marienfeld superior
년호

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Regulatory T CellsT Cell SuppressionFlow CytometryELISA AssayCD3 CD28 BeadsFoxp3 ExpressionLymphocytic ChoriomeningitisActivated T Reg CellsIn Vitro SuppressionPhenotypic Analysis

Related Articles