카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

요약

우리는 특정 카파(Vκ) 경쇄를 가진 인간 및 마우스 IgM 항체에 대한 항원을 포함하는 단백질 부분을 식별하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 IgM 계열 항체에 국한되지 않고 면역침전 중에 충분히 높은 친화력으로 항원을 표적으로 하는 모든 면역글로불린 동형에 적용됩니다.

초록

IgM 동형의 항체는 인간 실험에서 잠재적인 치료제, 인간 질병의 동물 모델 및 표준 실험실 기술에서 인자를 검출하는 것으로 종종 무시됩니다. 이와는 대조적으로, 여러 인간 IgM은 암 모델 및 다발성 경화증(MS) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함한 중추신경계 장애 모델에서 효능의 증거를 입증했습니다. IgM 항체의 발현, 정제 및 안정화에 대한 어려움, (비단백질) 항원 식별에 대한 어려움, 낮은 친화성 결합, 탄수화물 및 지질 연구의 기본적인 지식 격차 등이 이에 대한 고려가 부족한 이유입니다.

이 원고는 HIgM12를 예로 들어 웨스턴 블로팅(western blotting), 면역침전법(immunoprecipitations) 및 면역세포화학(immunocytochemistry)에 의한 항원을 검출하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. HIgM12는 신경세포 접착 분자(NCAM)에 부착된 폴리시알산(PSA)을 표적으로 합니다. HIgM12에 결합하기 위한 NCAM의 중요성을 평가하기 위해 3가지 주요 중추신경계(CNS) 스플라이스 변이체인 NCAM180, 140 및 120이 결핍된 야생형(WT) 및 NCAM 녹아웃(KO) 마우스의 출생 후 초기 마우스 뇌 조직을 사용했습니다. 엔도네우라미니다아제를 사용하여 CNS 조직과 배양된 CNS 세포의 추가 효소 분해를 통해 PSA를 HIgM12에 대한 특이적 결합 항원결정기로 식별했습니다.

서론

대한 IgM 이소 타입의 항체는 암, CNS 장애 ^1-7 포함한 각종 질환의 치료에 큰 치료 적 잠재력을 보여준다. Vollmers '그룹은 암 특이 바이오 마커 또는 세포 사멸 경로 ^4,8,9을 유도하여 악성 세포를 죽일 수있는 활성 치료제 잠재적 인 사용을 위해 암 환자에서 다수의 항체를 확인했다. 흥미롭게도, 치료 가능성을 가진 모든 확인 된 항체는 IgM의 이소 타입의하고 "자연자가 항체"(NABS)의 그룹에 속한다.

마찬가지로, 게스의 그룹은 마우스 및 다발성 경화증 (MS)의 모델에서 만성 척수 탈수 초 병변에서 재유 수화 자극 인간 항체를 확인 하였다. 항암 효과와 항체와 동일, 모든 재유 수화 촉진 항체는 NABS이며, IgM의 이소 타입 ^1,6,7,10의. 대부분의 식별 IgMs에 대한 정확한 항원은 여전히​​ undetermine 있습니다임상 시험 MS 환자 ¹¹ 현재 단계에서 인간의 재유 수화 촉진 항체 rHIgM22 포함 라. 학술 설정 및 산업 ^(11)와 협력하여 모두 지질과 탄수화물의 연구 분야의 전문가에 의해 반복 된 노력에도 불구하고, rHIgM22의 항원이 성공하지 식별을 시도합니다. 대한 IgM 항체와 작업의 IgG 항체의 항원을 식별하는 데 사용되는 표준 기술의 실패는이 항체 가능성이 가장 높은 대상 탄수화물이나 지질 항원에 대한 구체적인 방법을 구체화하는 중요한 필요성을 식별합니다.

이 논문의 초점은 인간 항체 회생 HIgM12 및 항원을 식별하기 위해 사용 된 실험 절차이다. 항체가 HIgM12 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 환자에서 확인하고, 시험 관내에서 신경 돌기 ^12-14 생장을 촉진하고, 신경 세포 부착 분자 (PSA-NCA 부착 polysialic 폰산 (PSA)을 타겟팅M) ^{15, 16.} HIgM12는 ALS ^(17)의 마우스 모델에서 수명을 연장하고 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 (TMEV) -infected 마우스의 기능 결과를 향상시킵니다. 복강의 단일 저용량 항체 ^(18)를 주입 한 후 특히, HIgM12 중소 직경 척수 축삭 8 주 만성 탈수 초 마우스와 증가 수의 자연 수평 및 수직 모터 활동을 자극한다.

신경 세포 부착 분자 (NCAM)는 수퍼 패밀리 뉴런, 아교 세포, 골격근 및 자연 살해 세포의 ^19-25 세포 표면에 발현 된 면역 글로불린 (IG)의 당 단백질이다. NCAM180, NCAM140 및 NCAM120라고 세 가지 주요 NCAM 동종 그들의 세포질 도메인 만 다를 차 성적 증명서의 대체 스플 라이스 변종이다. 중추 신경계 내에서 NCAM 길고 음전하 시알 산 호모 폴리머와 주요 polysialylated 분자 (> 95 %)이다. Polysialic a를N> 10 CID는 PSA이라고한다하지만 짧은 올리고머 구조는 생물학적 관련성이 존재한다. 중추 신경계에 표명 polysialylated 단백질 SynCAM1 ²⁶ 뉴로 필린 -2- (NRP-2) ^{(27, 28)이며,} 나트륨 채널 서브 유닛 ⁽²⁵⁾ (검토를 위해 ^{29 참조).}

여기에 기술 된 방법에 관계없이, 항체의 이소 타입 (예를 들어, IgG를, IgM의 특정 카파 (Vκ) 경쇄 (인간 항체, 마우스 항체 VκI 경쇄 대 VκI, VκIII 또는 VκIV 경쇄)를 포함하는 인간 및 마우스 면역 글로불린에 대한 항원 인식을 허용 이가, IgD의 또는 IgE 항체). 이 제한은 IgM의 이소 타입의 항체와 면역 침전을위한 단백질 L 아가로 오스의 사용을 기반으로합니다. 대체 전략 INC 더 대한 IgM 항체이 방법의 적용 범위를 확장 할 수있다 만노스 - 결합 렉틴과 공유 비드를 아가로 오스 연결된 보조 IgG 형 대한 IgM 항체를 포함 할 수있다람다 (λ) 빛 체인 사람들을 luding (설명 참조). 1 ~ ³⁰ : 건강한 사람에서 파생 된 IgM의 λ 경쇄에 비해 혈청 IgM의 Vκ 경쇄의 비율은 1.5이다.

분리, 농축 및 면역 특정 분자 ^(31)를 검출하기 위해 여기에 사용되는 크로마토 그래피 방법에 기초하여, 모든 항원은 적어도 하나의 작은 단백질 도메인을 포함해야한다. 항체의 특이 적 결합 에피토프 내에서 또는 (당 단백질, 지질 단백질의 예) 단백질 도메인 외부 될 수 있습니다. 잠재적 인 후보의 목록을 좁힐 각각, HIgM12의 특정 항원을 식별하는 데 사용 초기 생화학 적 단계는,이 방법에서 가장 중요한 단계입니다. 세포 유형 특이 제제 및 세포 형태 기반 특성화는 신경 교세포에 대해 기재되어 있지만,이 방법은 CNS 내 또는 외부의 다른 세포 유형을 수용하도록 외삽 될 수있다.

긴급한가있다항체 표적은 탄수화물이나 지질 구조입니다 치료 특히 경우에 다른 인간 질환에 대한 잠재적 인 (IgM의 항원의 대부분)에 대한 IgM 항체의 증가에 적용 할 새로운 또는 수정 된 기술을 개발해야합니다.

프로토콜

동물 프로토콜과 절차는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고, 메이요 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 메이요 프로토콜 번호 # A51912)에 의해 승인되었다.

1. 일반 CNS 조직 준비

1. 이형 접합체를 건너, 이형 NCAM 마우스와 야생형 (WT) 한배 새끼 (C57 / BL6) (친절 박사 린 Landmesser, 케이스 웨스턴 리저브 대학, 오하이오 주 클리블랜드에서 제공) C57 / BL6 배경에 NCAM의 결핍 (KO) 마우스를 생성합니다. NCAM KO 마우스의 유전자형 이전 ^32-34을 설명하고, 더욱 구체적으로 설명되지 않을 것이다.

참고 : 1.2 단계 - 1.6는 선택 사항입니다.

2. 수술 이전하는 펜토 바르 비탈 솔루션을 관리 (재고 : 25 ㎎ / ㎖, 초기 출생 후의 각각의 성인 단계에 대한 펜토 바르 비탈의 100 분의 50 μL) 복강 내 주사 (27 게이지 바늘과 1ml를 통해주사기).
3. 2 분 동안 기다리거나 동물까지 마취의 수술 비행기에 도달했습니다. 수술 적 단계의 마취를 유지하기 위해 각 작업 과정에서 필요에 따라 추가로 마취제를 투여. 마취의 깊이를 결정하기 위해 발가락 핀치 응답 방법을 사용합니다. 동물들은 계속하기 전에 응답해야합니다.
4. 바로 흉곽 아래의 외피와 복부 벽을 통해 1cm 측면 절개 - 0.5합니다. 조심스럽게 다이어프램에서 간을 구분합니다. 곡선, 무딘 가위를 사용하여 횡경막에 작은 절개를합니다. 흉강을 노출 흉곽의 전체 길이를 따라 조리개 절개를 계속한다.
5. 조심스럽게 폐를 변위, 흉곽의 한 측면을 따라 곡선, 무딘 가위를 놓고 쇄골에 흉곽 위로를 통해 상처를합니다. 반대쪽 측면에 비슷한 상처를 확인합니다. 멀리 흉골을 들어 올려 조심스럽게 심장에 연결하는 조직을 잘라.
6. 동물에 절개를합니다'가능한 한 큰 출구를 만들 홍채 가위를 사용하여 우심방을이야. 천천히 동물의 좌심실로 인산염 완충액 (PBS) 10 ㎖를 주입 (적색광, 유속 : 1 ㎖ / 분)을 27 게이지 바늘이 장착 된 10 ㎖ 주사기를 이용하여. 조직 파괴를 방지하기 위해 관류시의 압력 / PBS 흐름을 증가시키지 않는다.
7. 수술 가위를 사용하여 신생아 쥐 목을 벨.
8. 겸자로 눈 소켓을 잡아와 척추에 작은 가위를 삽입하여 뇌를 제거합니다. 귀 수준에서 앞쪽으로 두개골을 잘라. 껍질은 다시 두개골과 부드럽게 얼음에 얼음처럼 차가운 해부 매체의 10 ㎖ (표 1) 가득 60mm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 각각의 뇌를 놓고 즉시 드라이 아이스에 저장 (-79 ° C).
9. 얼음에 깨끗한 면도날을 사용하여 냉동 뇌에서 소뇌 및 뇌 줄기를 절개. 조직을 해동 방지하기 위해 신속하게 작동한다.
10. 체중냉동 대뇌 얼음에 15 ㎖의 튜브에 넣고 ㎕의 용해 완충액 당 150 μg의 뇌 조직의 최종 농도 빙냉 용해 완충액 (표 1 참조)를 추가한다. cerebra 나머지에 대해 반복합니다. 단계 1.9에 대해 항상 얼음에 머리를 유지 - 1.11.
11. 27 게이지 바늘 (10 배)가 장착 된 5 mL를 주사기를 통해 저작하여 1 ml의 피펫 팁 (10 회)를 통해 분쇄하여 용해 완충액에서 균질화 뇌. 전체 조직을 용해 할 수 있도록 얼음에 추가로 30 분 동안 뇌 해물을 품어.
12. (4 ° C에서 10 분 동안 19,000 XG에 네 라운드) 세제 불용성 물질과 뇌 직렬 원심 분리를 통해 지질을 제거합니다. 폐기 (흰색) 수초와 펠렛을 함유하는 세포 파편하지만 모든 원심 분리 단계 후 상등액을 유지합니다. 나누어지는 뇌 해물 저장 -80 ºC에서.

Cerebra에서 "풀다운"에이전트와 같은 인간 IgMs (HIgM12 및 이소 제어 IgM의)를 사용하여 2. 면역 침전WT의 리터 해물과 NCAM KO 마우스

1. 단백질 L 아가로 오스 비드 준비 ^9,35,36
   1. BSA (표 1 참조)를 포함한 IP 완충액 200 ㎖를 준비한다. BSA 않고 동일한 IP 버퍼의 또 다른 200 mL의 준비.
   2. 면역 반응 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 200 μL 피펫을 사용하여 단백질 L 아가로 오스 슬러리를 100 ㎕ 당. 하지 소용돌이 단백질 L 아가로 오스 비즈를 수행합니다! IP 완충액 1 ㎖를 추가하는 각 튜브 (표 1 참조). 단백질 L 아가로 오스와 반전을 통해 수동으로 IP 버퍼 (다섯 번) 섞는다.
   3. 벤치 탑 원심 분리기에 세척 단백질 L 아가로 오스 비즈 원심 분리하여 네 번 (1000 XG, 2 분, 25 ° C). 아가로 오스 펠렛을 방해하지 않고 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 벗어. 반복 세척 2.1.2 세 2.1.3에 추가 번 단계를 반복합니다.
   4. 4 ºC에서 밤새도록 롤러에 새롭게 추가 된 IP 완충액 1 ml 중에 단백질 L 아가 평형.
2. 서양 오 점에서 항체 - 항원 아가로 오스 L 복합체 형성 및 항원 검출
   1. 4 ºC에서 롤러 밤새 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 대한 IgM 항체 (HIgM12) 20 μg의 얼음처럼 차가운 IP 완충액 1 ㎖에 용해 뇌 조직 (~ 200 ㎕의 용 해물) 30 mg의 인큐베이션.
   2. 1000 XG, 4 ºC에서 2 분 동안 벤치 탑 원심 분리기 (단계 2.1.4에서) 단백질 L 아가로 오스 비즈를 스핀 다운. 아가로 오스 펠렛을 방해하지 않고 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 1 ML의 피펫을 사용하여 단백질 L 아가로 오스에 (단계 2.2.1)에서 냉각 된 항체 뇌 해물 솔루션을 추가합니다.
   3. 4 ºC에서 롤러에 2 시간 동안 항체 - 항원 단백질 L 아가 현탁액 인큐베이션. 2 분, 4 ºC 1,000 XG에서 원심 분리를 통해 L을 아가로 오스에 부착 된 항체 - 항원 복합체를 씻으십시오. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 버리고 0.2 % BSA를 포함하는 얼음처럼 차가운 IP 버퍼 1 ㎖를 추가합니다.
   4. 0.2 % BSA 및 BSA없이 빙냉 IP 버퍼를 이용하여 두 개의 추가 시간을 포함하는 빙냉 IP 버퍼를 사용하여 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
   5. 2 분, 4 ºC 1,000 XG에서 L을 아가로 오스에 부착 된 항체 - 항원 복합체를 스핀 다운. 완전히 처음 용액 50 μL가 10 μl를 피펫 다음에 단백질 L 아가로 오스 펠렛의 상단에 남아 있습니다 ~까지 200 μL 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 얼음에 샘플을 유지합니다.
   6. IP 용출 완충액 40 μl를 추가 95 ºC에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 손가락 제스처 튜브 6 회 열마다 (표 1 참조). 2 분 동안 얼음에 샘플을 넣고 13,000 XG, 4 ºC에서 30 초 동안 스핀 다운.
   7. 펠렛을 방해하지 않고 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 10 μl의 피펫 (~ 35 μL 총)를 사용하여 상층 액을 전송합니다. 내부 튜브 벽에서 용출 소량의 시료를 세척하여 단백질 L 아가 구슬의 유무를 확인한다.
      참고 : "세분화"단백질 L 아가로 오스 비즈는 분명히 존재하는 경우 볼 수 있습니다.
   8. 단백질 L 아가로 오스 비즈있는 경우, 13,000 XG에서 또 다른 30 ​​초 동안 샘플을 스핀 다운 튜브를 청소 뜨는을 전송합니다. 어떤 아가로 오스 비즈 검출 없을 때까지 단계를 반복합니다.
   9. 로드 10 - 트리스 / 글리신 / SDS 버퍼 시스템의 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 웰 당 용출 된 샘플 20 μL (표 1 참조).
      참고 : - : 8.6 X 6.7 X 0.1 cm)를 사용하여 7.5 % 또는 4 PSA-NCAM 또는 NCAM 이성체 (겔 크기 (폭 x 길이 x 두께의 검출에 잘 당 50 μl를 적재 용량 20 % 그라데이션 젤.
   10. 벤치 탑 100 V에서 ~ 1 시간 동안 실행 젤 (1.74 V / cm ^2). 추가 냉각이 단계 ^37,38 필요하지 않습니다.
   11. PVDF로 전송 단백질 (폴리 비닐 리덴 플루오 라이드) 막 차가운 전송 버퍼 사용하여 100 V의 추운 방에서 2.5 시간 (1.74 V / cm ^2)에 대한 (공극 크기 0.45 μm의) (5-10 ºC)을 (표 1 참조).
   12. 블록 막 wi 번째 10 % (W / V)는 벤치 탑 궤도 통에 25 ºC에서 1 시간 동안 PBS-T에서 분유 분말, PBS-5 %의 BSA에 차 항체와 하룻밤 10 PBS-T와 분, 프로브 두 번 세포막을 씻어 추운 방에서 궤도 통에 T.
   13. 25 ºC에서 간단히 초과 PBS-T와 다음날 아침 씻어 막 한 시간은 10 분 궤도 흔드는 각 (80 회전)에 대한 PBS-T 3 세척 한 다음 (뚜껑과 용기 포함) (모든 세척 단계 25에서 수행됩니다 ºC).
   14. 이차 항체를 추가 (고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 HIgM12 안티 인간 항 IgM의 항체 () (희석 1 π 공역 계 : 궤도 진탕 기에서 25 ºC에서 1 시간을위한 PBS-T의 5 % 분유 분말 30,000) (70 rpm으로 ).
   15. 워시 막 광범위 25 ºC에서 간단히 초과 PBS-T와 함께 한 시간은 10 분 궤도 흔드는 각 (80 회전)에 대한 PBS-T 3 세척 한 다음 (뚜껑과 용기 포함) (모든 세척 단계는 25 ºC에서 수행됩니다) .
   16. 냉장 강화 chemiluminescen 1 ㎖를 혼합25 ºC에서 (미니 오 당) 구성 요소 B (산화제) 1 ㎖와 가전의 HRP 기판 구성 요소 A (강화 루미놀 시약).
   17. (아주 가장자리를 잡고)를 초과하는 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 세포막을 전송하는 플라스틱 집게를 사용합니다. 다시 용기에 종이 타월 넣어 막 건조 용기 (각 막에 대해 하나). 즉시 각 막에 미리 혼합 된 강화 된 화학 발광 HRP 기질 (화합물 A + B) (단계 2.2.16.) 2 ㎖를 추가하고, 진탕 기 (90 RPM) 25 ºC에서 2 분간 배양한다. 확인 막을 균일하게 발광 시약에 의해 묻혀있다.
   18. 투명 플라스틱 슬리브로 전송 세포막을하고 종이 타월로 물기와 공기 거품을 제거합니다. 필름 카세트에 플라스틱 슬리브에 막 넣어 결국 카세트에 플라스틱 슬리브를 테이프. 카세트를 닫습니다.
   19. 암실에 카세트, 영화, 타이머와 가위를 가져 가라. 각 파이에서 오른쪽 상단 모서리를 잘라배향 상업적 필름은 다양한 기간에 대한 (다른) 필름 (10 초, 1 분, 10 분)에 노출시켜 막 현상액 필름을 개발한다.

NCAM ^(39)에 부착 PSA 3. Endoneuraminidase-NF 소화

1. 표 2 ^(39)에 도시 된 바와 같이, 출생 당일 (P) 7 WT 마우스와 P7 NCAM KO 마우스로부터 다이제스트 용해 뇌 조직 endoneuraminidase-NF (ENDO-NF)을 이용하여 얼음 위에서 2 시간 동안 (단계 1.12부터 제조 됨).
2. 단계 3.1 (표 2)에서 - 각 튜브 (6 일)에 4 배 램 믈리 샘플 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
3. 4에로드 샘플 - 20 % 구배 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔를 반복 2.2.19로 2.2.10 단계를 반복합니다. PBS에서 5 % BSA에서 HIgM12 (1 μg의 / ㎖) 시판 항 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (1 μg의 / mL) 및 β 액틴 항체 (하중 제어) (1 μg의 / ㎖)와 프로브 멤브레인 -티.

쥐와 마우스 CNS 문화 4. 준비

1. 유리 Coverslips는 제조
   1. 유리 용기를 사용하여 흄 후드에서 16 시간 - 4 60 ºC - 50에서 1 M 염산에 산 세척 25mm 커버 글라스. 가끔 부드러운 소용돌이를 통해 커버 슬립을 선동.
   2. 세척 유리는 광범위하게 증류수 (3 배)으로 된 커버. 누적 된 커버 사이에 산을 씻어해야합니다.
   3. 100 % 에탄올에 커버 슬립을 씻어 세포 배양 후드에서 파라 필름에 그들을 건조. 하루 사용하기 전에, 오븐에서 100 ºC에서 뚜껑을 유리 용기에 24 시간 동안 유리 커버 슬립을 가열한다.
   4. 37 ºC에서 1 시간 동안 멸균 물에 40 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 3 ㎖와 6 자 요리와 코트 커버 글라스를 넣습니다.
   5. 멸균 물로 2 회 세척 세포 배양 후드 완전히 건조 20 분 동안 자외선을 적용합니다.
2. CNS 세포에 대한 조직 문화 플라스틱의 제조
   1. 3 코트 60mm 세포 배양 접시 또는 75cm ^두 조직 문화 플라스크용액 10 ml를 각각 37 ºC에서 1 시간 동안 멸균 수 / ㎖ 폴리 D 라이신 40 μg의 중.
   2. , 물로 2 회 세척 세포 배양 후드 완전히 건조 20 분 동안 자외선을 적용합니다.
3. 쥐 혼합 아교 절연 ⁽⁴⁰⁾
   1. IACUC는 CO ₂ 가스 공급 (완전이 자동화)와 쥐 안락사 챔버 승인에 신생아 쥐를 마취. 동물의 응답 중지를 결정하기 위해 발가락 핀치 응답 방법을 사용합니다. (- 한 번에 10 새끼 6) 신생아 스프 라그 돌리 쥐 (P0P1)를 목을 벨.
   2. 겸자로 눈 소켓을 잡아와 척추에 작은 가위를 삽입하여 뇌를 제거합니다. 귀 수준에서 앞쪽으로 두개골을 잘라. 껍질은 다시 두개골과 부드럽게 (표 1 참조) 얼음에 얼음처럼 차가운 해부 매체 10 ㎖로 가득 60mm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다.
   3. (- 10 새끼 6) 쥐의 새끼를 나머지에 대해 반복합니다. 4.3.7 - 4.3.2 단계 얼음에 조직을 유지합니다.
   4. 두 대뇌 반구에 중간 선을 따라 대뇌를 나누고 이후 후각 전구, 기초 대뇌 피질 아래의 신경과 뒤몽 집게로 해마를 잘라. 얼음에 매체를 해부가 포함 된 깨끗한 페트리 접시에서 고립 대뇌 피질을 놓습니다.
   5. 하나 피질을 가져 가라. 해부 현미경 미세 팁 포셉으로 수막을 제거합니다.
   6. 나머지 피질과 반복합니다. 얼음에 한 깨끗한 페트리 접시에 모든 수막없는 피질를 놓습니다.
   7. 60mm 페트리 접시에 모든 새끼에서 대뇌 피질 반구를 결합하고 조각을 다진 1mm로 뇌 조직을 주사위하기 위해 멸균 면도날을 사용합니다.
   8. 멸균, 코팅 된 500ml의 유리제 플라스크에 10 ㎖ 피펫을 사용 다진 뇌 조직을 옮기고 쥐 뇌 당 빙냉 해부 배지 10 ㎖를 추가한다. 쥐의 뇌 당 HBSS 9 ml의 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) (5 ㎎ / ㎖ 트립신)에 트립신 용액 1 ㎖를 추가하는 동안 조심스럽게 플라스크를 소용돌이 친다. 2 추가의 DNase I 용액 (1 ㎎ / ㎖) 및 _황산 용액의 총 부피의 2 %의 총량의 % (HBSS에서 3.82 % _황산 (W / V)) 뇌 조직의 현탁액에 천천히 소용돌이 친다.
   9. 37 ºC에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 진탕하에 부드러운 티슈를 Trypsinize. 확인 조직 조각이 단계에서 부동하고 아래로 침전되지 않도록합니다. 필요한 경우 회전 속도 증가.
   10. 10 % (v / v)의 최종 농도의 소 태아 혈청 (FBS)를 첨가하고, 10 초 동안 10 번 플라스크를 소용돌이에 의해 혼합한다. 15 분 동안 얼음물에서 조직 현탁액을 냉각. 소용돌이 부드럽게 다섯 번 매초마다 분 플라스크.
   11. 조심스럽게 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 25 ㎖ 또는 50 ㎖ 피펫 원심 분리기를 이용하여 50 ㎖ 멸균 된 튜브에 조직 현탁액을 전송.
   12. 0.4 ml의 _황산 용액을 뜨는을 취소하고 부드럽게 (15) 소 태아 혈청을 5 ml의 보충 얼음처럼 차가운 해부 매체의 ml의 소화 CNS 조직을 재현 탁 (3.82 %HBSS에서 _{황산)과의} DNase I (1 ㎎ / ㎖)을 1.6 ㎖의.
   13. 두 멸균 15 ㎖의 튜브에 균등하게 분할 조직 현탁액 (~ 10 씩으로) 천천히 정지가 혼탁 / 우유 빛이 될 때까지 10 ml를 피펫 (10 회)를 사용하여 씹다. 다음 튜브를 처리하는 동안 얼음에 중단 세포를 유지합니다. 소화 CNS 남은 튜브의 바닥에 침전물을 어떤 조직이 될 때까지 3 분 동안 기다립니다. 전송 상등액을 펠렛 분획을 방해하지 않고 50 ML 튜브를 청소합니다.
   14. 선택적으로, 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 혼탁 한 상층 액을 통과하고 얼음에 멸균 50 ㎖ 튜브에 생성 된 단일 세포 현탁액을 결합한다.
   15. 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 세포 슬러리를 스핀.
   16. 매체를 해부의 ~ 2 ml의 세포 펠렛의 상단에 남을 때까지 조심스럽게 10 ML의 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
   17. 50 ㎖ 튜브 (~ 10 배)에 손가락 영화 세포 펠렛. 서서히 가온 성장 배지 5 ㎖를 추가 세포 현탁액하면서 부드럽게 (표 1 참조)손으로 튜브를 소용돌이.
   18. 선택적으로, 눈에 보이는 조직 클러스터 또는 DNA 덩어리의 경우 신선한 DNase의의 I 용액과 _황산 -solution 얼음에 추가로 10 분 동안 DNase의 단계 4.3.12를 반복합니다. 소용돌이 튜브 수동 5 회 초마다 분.
   19. 접시 50,000 6 웰 접시에 400 ㎕의 성장 배지의 웅덩이 25mm 유리 커버 슬립 당 세포와 세포를 세포 배양 용 인큐베이터 (5 % CO _2, 37 ° C)에서 30 분 동안 부착하자.
   20. 합류를 들어 (24 내 - 48 도금 후 시간) 60mm 세포 배양 요리와 75cm ^두 조직 문화 플라스크, 판 50 세포 (60mm 접시) 또는 2 백만 세포 (75cm ² 플라스크).
   21. 조심스럽게 2ml를 추가 (당 물론, 25mm 커버 글라스 6 잘 접시), 3 ㎖ (60mm 요리) 또는 각 따뜻한 성장 배지 10 ㎖ (75cm ² 플라스크)이 아니라. 하룻밤 세포를 품어 다음날 아침 매체를 완전히 변경합니다. 다음 중 매일 (등 3 일, 5 일, 하루 7)로 변경합니다.
       아니테 : - 48 시간 도금 후 쥐 혼합 된 아교 세포 배양은 24 면역 세포 화학 또는 생화학 사용할 준비가 된 것입니다.
4. 마우스 혼합 폐해 문화
   1. 4.3.1 4.3.6에 절에 설명 된 신생아 쥐 뇌의 해부, C57 / BL6 배경으로 P0 신생아 WT와 NCAM KO 마우스의 목을 벨의 머리를 제거하고 얼음처럼 차가운 해부 매체에 넣어 동일합니다 (표 1 참조). 항상 얼음에 조직을 유지합니다.
   2. 두 대뇌 반구에 중간 선을 따라 대뇌를 나누고 이후 후각 전구, 기초 대뇌 피질 아래의 신경과 뒤몽 집게로 해마를 잘라. 얼음에 HBSS를 포함하는 깨끗한 페트리 접시에서 고립 대뇌 피질을 놓습니다.
   3. 하나 피질을 가져 가라. 해부 현미경 미세 팁 포셉으로 수막을 제거합니다. 나머지 피질과 반복합니다. 얼음에 한 깨끗한 페트리 접시에 모든 수막없는 피질를 놓습니다.
   4. 대뇌 피질의 hemisphe 이동별도의 멸균 15 ㎖의 튜브에 각 마우스에서 1 ml를 피펫으로 입술. 각각의 뇌에 1.2 ml의 얼음처럼 차가운 해부 매체를 추가하고 기계적으로까지 그 2 번 피펫 팅에 의해 1 ML의 피펫 팁을 사용하여 아래로 뇌 조직을 방해.
   5. 150 ㎕를 파파인 솔루션 (PBS에서 10 ㎎ / ㎖), 100 μL의 DNase I 솔루션 (HBSS 1 ㎎ / ㎖) 및 각각의 뇌에 50 μl의 _황산 (HBSS의 3.82 %)를 추가하고 손가락으로 쓸어 넘겨 섞는다.
   6. 수욕에서 37 ºC에서 30 분 동안 뇌 서스펜션을 품어 뇌 현탁액을 손가락으로 쓸어 넘겨 초마다 분을 섞는다. 튜브 당 FBS의 1 ML을 추가 혼합하고 얼음에 10 분 동안 조직 현탁액을 냉각.
   7. 200 XG 4 ºC에서 4 분 동안 뇌 조직을 스핀 다운하고 황산에게의 DNase I 용액 70 μL (1 밀리그램 / HBSS에서 ㎖) 30 ㎕를 보충 빙냉 해부 완충액 1 ㎖에서 ₄ 해결책 티슈 펠렛을 재현 탁 (HBSS의 3.82 %).
   8. 하여 뇌 조직 씹다 FBS를 피복 한 ml의 피펫 팁(~ 5 배) 상등액 혼탁해질 때까지. 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전달하고 얼음에 깨끗한 튜브로 전송할 수 있습니다.
   9. 200 XG 4 ºC에서 5 분 동안 원심 분리를 통해 혼합 교세포 펠렛. 매체의 대기음 뜨는 100 ~까지 μL은 세포 펠렛의 상단에 남아 있습니다. 손가락 튕기 (~ 5 배) 따뜻한 마우스 성장 배지 1 ㎖를 추가하여 재현 탁 된 세포 펠렛 (표 1 참조).
   10. 선택적으로, 눈에 보이는 세포 클러스터와 용해 세포를 용해 / 부드럽게 아래로 세포 현탁액의 위 (다섯 번) 피펫 팅하여 DNA를 침전.
   11. 4.3.21 - PDL 코팅 된 커버 글라스 또는 60mm 요리 접시 마우스 혼합 된 아교 세포 단계 4.3.19에 설명 된대로. 따뜻한 마우스 성장 매체 및 이후 매일과 다음날 아침 세포를 씻으십시오. 도금 후 72 시간 - 마우스 혼합 된 아교 세포는 면역 세포 화학 (48)에 대해 사용할 수 있습니다.
5. 쥐 미세 아교 세포 분리
   1. 문화 쥐 혼합성장 배지에서 75cm ² 조직 배양 플라스크에서 신경교 10 일 (표 1 참조). 1 시간 동안 140 rpm에서 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO _2, 37 ° C) 내부의 회전 진탕 기에서 혼합 된 아교 문화 소교 세포 클러스터를 흔들어.
   2. 혼합 아교 ​​세포 배양에서 미세 아교 세포 함유 뜨는을 벗고 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 전달하고 멸균 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 유지합니다.
      참고 : 소교 문화가 몇 오염 개 OPC와 거의 성상이 단계 이후에 일반적으로> 95 % 순수입니다.
   3. 선택적으로, 미래 소교 흔들림 오프에 대한 혼합 된 아교 세포 배양에 성장 매체를 교체합니다. 일반적으로 혼합 폐해 문화에서 (한 번 주당) 여러 소교 흔들림 오프를 수행합니다.
   4. 선택적으로, 순도 95 % 이상 판을 100mm 배양 접시 당 미세 아교 세포 - 함유 상등액 (단계 4.5.2) 10 ㎖를 얻을 37 ºC에서 30 분 동안 세포 배양기에서 배양. 만 microgl성상 교세포와 개 OPC가 뜨는에 남아있는 동안 아이오와는 배양 접시에 부착됩니다.
   5. 천천히 시계 방향과 반 시계 방향으로 세포 배양 후드 (오 회)를 배양 접시를 흔들. 흡 인물 세포 배양 배지는 완전히 성장 배지 10 mL로 교체한다. 결과 미세 아교 세포 배양은 98 % 순수>입니다.
   6. DMEM에서 최대 7 일 동안 배양 된 미세 아교 세포는 1 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충.
6. 쥐 OPC / 희소 돌기 아교 세포 분리
   1. 매우 풍부한 OPC 문화가 1 시간 동안 140 rpm에서 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO _2, 37 ° C) 내에서 회전 진탕 기에서 75cm ² 플라스크에서 재배 10 일 이전 혼합 폐해 문화에서 처음으로 미세 아교 세포를 떨쳐 구하십시오. 미세 아교 세포 만 함유 뜨는을 폐기 또는 미세 아교 세포 관련 실험 (단계 5.5 참조) 사용합니다.
   2. 10 ml의 성장 매체와 소교 함유 뜨는을 교체하고 대한 혼합 된 아교 문화를 떨쳐200 RPM (5 % CO _2, 37 ° C)의 회전 진탕 기에서 또 다른 18 시간.
   3. 혼합 된 아교 세포 배양에서 microglia- 및 OPC 함유 뜨는을 수집하고 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 멸균 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
   4. 선택적으로, 미래의 OPC 흔들림 오프에 대한 혼합 된 아교 세포 배양에 성장 매체를 교체합니다.
      참고 : OPC를 낮은 금리로,이기는하지만, 성상 세포 피더 레이어에 증식을 계속 흔들어 오프 할 수있는 두 번째와 세 번째 시간 (일주일에 한 번).
   5. 판 microglia-과 100mm 배양 접시에 뜨는 OPC가 함​​유 37 ºC에서 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 부화 10 ㎖. 개 OPC와 성상 세포가 뜨는에 남아있는 동안 미세 아교 세포는 배양 접시에 부착됩니다.
   6. 천천히 시계 방향과 반 시계 방향으로 세포 배양 후드 (5 회)를 배양 접시를 흔들. 세포 배양 인큐베이터에서 한 번에 몇 개의 배양 접시를 꺼내 (미세 아교 세포는 애완 동물에서 빠지 시작됩니다쿨러 매체에 격렬하게 흔들 리 요리).
   7. 수집하고 50 ㎖ 튜브에 OPC 함유 뜨는을 결합한다. 선택적으로, 미세 아교 세포 관련 실험에 사용하기 위해 배양 접시에 배지를 추가합니다.
   8. 선택적으로, 더 OPC 준비에 미세 아교 세포의 정도를 낮추기 위해 새로운 배양 접시에 한 번 단계 5.6.5과 5.6.6를 반복 OPC 문화의 순도를 증가시킵니다.
   9. 250 XG, 4 ºC에서 5 분 동안 원심 분리기에서 농축 OPC 함유 상층 액을 스핀. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. 펠렛의 상단에 뜨는 3 ㎖를두고 손가락 긋기 (10 회)에 의해 개 OPC를 재현 탁 시작합니다.
   10. (- 10 배 5) 10 ml를 피펫을 사용하여 천천히 씹다 OPC 세포 클러스터.
   11. 세포를 세어 6 웰 접시에 400 ㎕의 성장 배지의 웅덩이 25mm 유리 커버 슬립 (PDL은 코팅) 당 50,000 개 OPC를 접시에 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 30 분 동안 부착하도록 (5 % CO _2, 376; C). 부드럽게 잘 각각에 따뜻한 증식 배지 (표 1 참조) 2 ㎖를 추가합니다. 증식 배지 3 ㎖에서 150 만 개 OPC -를 들어 60mm 세포 배양 용 접시, 플레이트 (1)를 PDL 코팅.
   12. 조심스럽게 OPC를 도금 후 신선한 확산 매체 3 시간으로 확산 매체를 FBS가 함유 교체 (제대로 연결 확인 개 OPC을 중간 변경시 꺼 내려하지 않음). 교환 매체마다 두 번째 날.
       참고 : 마우스 OPC 배양은 일반적 성상 다음 주요 오염 세포 유형으로 미세 아교 세포와 90 % 순수이 프로토콜을 사용하여 제조.

기본 폐해 세포에 HIgM12 사용 5. 면역 세포 화학

1. HIgM12, 안티 PSA 단클론 항체 및 세포 유형 WT와 NCAM KO 마우스에서 기본 폐해 세포에서 특정 마커를 사용하여 트리플 라벨 면역 형광
   1. 생균 조건에서 라벨 60 % 융합 성 마우스 PDL 피복 성장 NCAM WT 및 KO 마우스로부터 신경교 배양 혼합HIgM12 (10 μg의 / mL) 및 PBS에서 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (10 μg의 / ㎖)와 25mm 커버 글라스를 30 분 동안 4 ºC에서 10 % FBS로 보충.
   2. 얼음처럼 차가운 PBS로 각각 10 % FBS와 보충 20 초 동안 세포를 세 번 세척하고 25 ºC에서 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드, pH를 7.4로 수정합니다.
   3. PBS로 각각 10 % FBS와 보충 1 분 동안 고정 된 세포를 두 번 세척하고 25 ºC에서 2 분 동안 PBS, pH를 7.4에서 0.1 % 트리톤 - X100과 세포를 Permeabilize 하시려면. 추운 방에 4 ºC에서 하룻밤 10 % FBS와 보충 1 분 동안 두 번 세포를 씻어 폐해 마커 GFAP (성상 세포) 또는 PBS에서 IBA-1 (미세 아교 세포) (1 μg의 / ml)로 레이블입니다.
   4. 매체 ^(31)를 장착 DAPI이 함유을 포함한 표준 면역 상태를 계속 진행합니다.
      참고 : 사용의 형광 인간 2 차 항체 (HIgM12)와 마우스 (안티 PSA 단클론 항체, 클론 2 - 2B)로 팹 ₂ 조각을 표시 IgMs이 좋습니다.
   5. FL을60X 또는 100X 배율에서 uorescent 이미지. 동일하게 모든 이미지 및 프로세스 이미지에 대해 동일한 장비 설정을 사용합니다.
2. 차 항체로 HIgM12를 사용하여 엔도-NF-처리 WT 아교 세포의 면역 형광 라벨
   1. 로 Neurobasal (A)에 3 일간 성장 문화 WT 마우스 혼합 아교 ​​세포는 PDL 코팅 25mm 유리 커버 슬립에 10 % FBS와 B27 보충제 (1시 50분)로 보충. 1 ml의 배양액에 ENDO-NF (30 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양한다 (37 ℃, 5 % CO _2).
   2. 5.1.1 5.1.5에 단계에 설명 된대로 라벨 세포는 HIgM12과 고정 및 permeabilization 후 내부 성상 세포 마커 GFAP와 추위에 살고 있습니다. 60X 또는 100X 배율에서 형광 이미지를 가져 가라. 모든 이미지에 동일한 장비 설정을 사용하여 동일하게 처리합니다.

결과

이 섹션은 CNS 인간 IgM의 특정 PSA 항원을 연구함으로써 얻을 수있는 결과의 예를 도시한다. 생화학 적 설정에서 형광 면역 세포에 의해 특정 Vκ 경쇄를 포함하는 인간 IgM의 항체의 용도가 도시되어있다.

HIgM12는 대뇌 뇌 해물로부터 항원을 immunoprecipitates과 서양 말에서 검출 에이전트 (차 항체) 역할을합니다. 어느 이소 타입 대조군 항체 나 아가로 오스 L 비즈 풀다운 (그림 1)의 특이성을 보여 유사한 항원을 면역 침전. WT 및 NCAM KO 마우스의 CNS 용 해물을 사용하여 웨스턴 블롯은 PSA 함유 NCAM을 (그림 2A)에 HIgM12이 결합의 특이성을 보여줍니다. ENDO-NF를 이용하여 WT 마우스에서 CNS 조직의 효소 소화 HIgM12 대한 특이 적 결합 에피토프 (도 2B로 NCAM에 부착 PSA 식별). 본원에 설명 된 방법을 이용하여 고순도의 IBA-1 양성 소교 배양 래트 (도 3)를 얻는다. 시판 방지 PSA 항체 (클론 2-2B)는 고정에서 세포 표면 또는 내부 PSA 풀 라벨 형광 현미경으로 IBA-1 양성 소교 세포 투과성이되지 않습니다. HIgM12는 정제 된 쥐의 미세 아교 세포의 세포 표면 항원에 레이블을하지 않는 미세 아교 세포 ^16,41에서 PSA-NCAM의 어떤 세포 표면 발현을보고하지 이전에 출판 된 문학과 일치. 흥미롭게도, 특정 세포 기관 (그림 3)에 한정되지 않고 세포 내에서 고정 투과성이 미세 아교 세포 결과, 핵 주변 패턴의 HIgM12 라벨링. 결과는 골지체 ^(41)의 레벨에서의 미세 아교 PSA-SynCAM 타겟팅 항 PSA IgG 항체 (클론 735) ^(26)를 이용하여 수득 된 것과 대조적이다.

미세 아교 세포는 달리 HIgM12라이브 셀 조건 (그림 4)에서 매우 풍부한 쥐 OPC의 문화 A2B5 대상 세포 표면 항원. OPC의 문화 소교 세포를 오염 ~ 5 %가 포함되어 있습니다. 5 GFAP 양성 성상 세포에서 HIgM12 및 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) 사이에 거의 동일한 세포 표면 염색 패턴 (그림 5A)를 보여줍니다. 엔도-NF-소화 WT의 성상 세포의 면역 형광 라벨은 HIgM12가 성상 세포 PSA (그림 5B)의 존재를 보여줍니다 사용하여 제어 처리 WT 성상 교세포 버퍼에 비해. 생체 내에서 PSA 양성 성상 세포의 존재는 여전히 확인되어야한다.

그림 1 :. HIgM12는 HIgM12를 사용하여 3 개월 된 생쥐의 총 뇌 해물로부터 면역 침전 면역 침전의 에이전트 "다운 당겨"인간 이소 제어 HIgM 역할전용 "풀다운"에이전트 등 (126) 또는 아가로 오스 L 구슬. 용출 된 단백질은 HIgM12에 대해 프로브 막과 서양 말에서 실행되었다. (- 73 kDa 이상 ~ 65)를 IgMs 중쇄 이외에 200 kDa의 - HIgM12 코팅 비드로부터 용출 된 단백질의 분자량 160의 범위에 있었다. 이 수치는 J.에서 수정되었습니다 Neurochem. ^(15). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : HIgM12가 Polysialic 산 (PSA) NCAM에 대한 부분을 목표로하고있다. P7, P13, P16와 P27 NCAM에서 A. 뇌 균질는 KO 마우스 및 이형 한배의 새끼 컨트롤 HIgM12, PSA 및 β - 굴지 부하 제어와 같은에 대해 프로브 막과 서양 말에 실행 된 총. J.에서 수정되었습니다 Neurochem. ^(15). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :. 쥐 미세 아교 세포에 PSA의 부재는 쥐의 미세 아교 세포는 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 글라스에 48 시간 동안 배양 하였다 HIgM12 라벨의 부족에 의해 미러와 하나 HIgM12 또는 HIgM12 또는 항과 고정 후 얼음에 라이브 표지 -PSA 단클론 항체 (클론 2-2B). 세포는 t이었다젤 중요한 미세 아교 세포 마커 IBA-1 (녹색), HIgM12 / PSA (빨강)과 DAPI (파란색)으로 표시. 이미지는 소교 세포 HIgM12 (위쪽 열)를 이용하여 결합면과 반대 PSA 부족 차 래트 미세 아교 세포 (아래쪽 열)에있는 세포 표면 및 내부에 저장 (복제 2-2B)에 결합 부재를 나타낸다. 양극성 형태와 IBA-1 얼룩의 유무에 기초하여, 소형 PSA 양성 세포 (아래쪽 열)은 OPC 것으로 시사되었다. 고정 된 세포에서 HIgM12 염색 특정 세포 기관으로 제한되지 않은 비 특이 적 결합 (중간 행)으로 간주 된 punctated, 핵 주변 패턴의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : HIgM12는 쥐 개 OPC에 세포 표면 PSA-NCAM을 대상으로 쥐 개 OPC와 미세 아교 세포가 cultu했다.HIgM12 또는 A2B5 (녹색), 내부 식세포 / 단핵 세포 마커 CD68과 얼음에 라이브 레이블 폴리 D 라이신 코팅 커버 글라스, 트리플에 증식 배지에서 4 일 동안 빨간색 (복제 ED-1) (빨강)과 DAPI (파란색) . 이미지는 OPC 마커 A2B5 (상단 행) 및 몇 CD68 양성 미세 아교 세포와 HIgM12 (하단 행) (~ 5 %)에 대한 세포 인구가 majorly 긍정적 보여줍니다. 위상 콘트라스트와 DAPI 이미지는 각각의 인구 세포 무결성 및 세포 수를 공개 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5 : HIgM12 및 안티 PSA의 단클론 항체는 마우스 혼합 글 리아의 성상 세포 모집단을 공동 레이블을 붙입니다. WT 및 NCAM에서 A. 마우스 혼합 된 아교 세포는 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 - 혈통 세포와 마이크로 그램을 포함 KO 동물 총LIA는 3 일간 배양 및 HIgM12 (녹색), 안티 PSA 단클론 항체 (클론 2-2B) (빨간색)이어서 성상 세포 마커 GFAP (보라색) 및 DAPI (파란색)에 대한 얼음에 라이브 표시. HIgM12 및 안티 PSA는 GFAP 양성 WT 성상 교세포의 가상 동일한 염색 패턴을 공개하지만 NCAM KO 마우스의 배양 성상 세포에 결합이 부족하다. 이 수치는 J.에서 수정되었습니다 A.에서 설명하고 (친절 박사 마르티나 Muehlenhoff에서 제공) endoneuraminidase-NF 또는 PBS 제어와 하룻밤 치료로 Neurochem. ^15. B. 혼합 된 아교 세포는 동일하게 배양 하였다. 세포 HIgM12 (녹색)이어서 내부 마커 GFAP (적색) 및 DAPI (파란색)에 대한 스테인드 얼음에 라이브 표시했다. HIgM12는 PBS-제어에 세포 표면 항원이 혼합 된 아교 문화를 처리하지만 endoneuraminidase-NF이 혼합 된 아교 세포를 치료 목표로하고있다. 이 수치는 JNSCI ^16에서 수정되었습니다. 경기 수쉽게이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모든 이미지는 동일한 장비 설정을 사용하여 60X 배율로 촬영과 동일하게 처리 하였다.

표 1 :. 버퍼 및 솔루션 조리법 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

	CNS 조직	엔도-NF / PBS	용해 완충액	총 볼륨
1. WT 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	2 μL (12 μg의) ENDO-NF	7.55 μL	10 μL
2. WT 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	2 μL PBS	7.55 μL	10 μL
3. WT 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	아니 PBS 또는 엔도 - NF	9.55 μL	10 μL
4. NCAM KO 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	2 μL (12 μg의) ENDO-NF	7.55 μL	10 μL
5. NCAM KO 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	2 μL PBS	7.55 μL	10 μL
6. NCAM KO 마우스	67 μg의 (0.45 μL)	아니 PBS 또는 엔도 - NF	9.55 μL	10 μL

표 2 : P7 WT와 NCAM KO 마우스의 CNS 조직의 ENDO-NF 소화.

토론

인간의 천연 대한 IgM자가 항체는 면역 요법에 대한 후보를 호소 암 및 CNS 장애 ^1-7 포함한 각종 질환의 치료에 치료 적 잠재 성을 보여 주었다. 바람직하게는, 이러한 항체는 중화 항체의 생성이 실질적으로 유효 치료 용량 및 효율을 감소 된 면역 반응을 유발하지 않을 것이다. 중요한 것은, 치료 가능성이있는 모든 항체는 IgM의 이소 타입의 왔으며 잡을 레퍼토리 ^{3-5,8,9,37,40,42-45에} 속해있다. 대한 IgM 항체의 임상 적 적용 가능성에 대한 주요 장애물은 많은 경우 미확인 그들의 항원의 확인이다. 의 IgG 항체에 이용 표준 기술은 종종 IgM의의 항원을 식별하는 데 적용 할 수 없습니다.

이 프로토콜은 동물 모델에서 효과적인 회생 인간 IgM의 항체 HIgM12위한 항원으로서 PSA-NCAM의 식별을 설명MS 및 ALS ^15-18의. 사용되는 방법에 관계없이, 항체의 이소 타입의 VκI 가벼운 사슬과 특이 Vκ 경쇄 VκI, VκIII 및 VκIV 마우스 항체 모두 인간 항체에 주로 적용된다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 공정은 친 화성 크로마토 그래피의 응용에 대한 IgM 항체의 용도이다. 구체적으로는, 항체를 성공적으로 분리 또는 복잡한 조직 - 또는 세포 배양 용 해물로부터 항원을 면역 침전에 풍부 풀다운 제로서 작용해야한다. 농축 항원 분획 이소 제어 항체의 면역 침전에 비해 후속 질량 분광기의 차이에 대해 분석 될 수있다. 하나의 필수 요구 사항이나이 단계의 제한은 단백질 L 아가로 오스에 결합하는 항체를 사용하려면 올바른 항체 Vκ 경쇄 및 호스트 (인간, 마우스)의 존재이다. 아가로 오스에 결합 만난 결합 단백질의 사용 (또한 칼레d 개 대신 단백질 L 아가로 오스의) 렉틴을 만노스 결합하면 특정 Vκ 빛 체인없이 IgMs을 면역 침전하는 잠재적 인 대안입니다. 아놀드 등. ^(35)에 의해 명시된 바와 같이하지만, 항원 - 결합 대한 IgM 항체는 IgM의가 그 항원에 결합되면 대상 글리 칸이 액세스 할 수 없게하는 표시로, 만난 결합 단백질에 결합하지 않는다. 이러한 발견에 기초하여 만난 결합 단백질하는 항원 로딩 IgM의 ³⁵ 분자 면역 침전하는 결합 매트릭스로서 사용될 수 없다. 다른 잠재적 인 대안이 보조 아가로 오스 바인딩 안티 IgM의 IgG의 항체 ^{46, 47} 또는 표면 활성화 자석 구슬 ^(48)의 사용의 사용 될 수 있습니다. IgMs 대항 대한 IgG 항체는 관심있는 항원과 함께 용출 된 항체의 정도를 감소시키기 위해 또는 G 아가 아가 로스를 화학적으로 가교 결합 될 수있다. 성공적으로 확인 된 항원에 대한 IgM 항체 면역의 다른 변종 사이의 적절한 비교 전대부분의 면역 침전이 분리 또는 항원에 더 관심없이 IgMs을 고갈 수행했기 때문에 어려운이야. 또한 IgMs를 사용하여 면역 침전 주로 정제 된 항원에 대한 항체 ^(49)의 노출 된 이미 알고 있거나 예상 단일 항원을 확인하는 데 사용 하였다. 출발 물질 ^(50)에 비해 면역 혈청 IgM의 분자 - (15 % 10), 인간 IgMs 대항 아가 IgG를 결합의 단점은 매우 저수율이다. 대조적으로, 표면 활성화 자성 비드 성공적 스크래피 관련 브릴 ⁴⁸ IgM의 면역 침전하는 등 다양한 이소 타입의 항체를 적용 하였다. 이 방법은 특정 카파 (Vκ) 또는 람다 (λ) 사슬 또는 특정 호스트에 한정되지 않고 실질적으로 면역 침전에 사용 대한 IgM 항체의 스펙트럼을 넓힐 수있다.

프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 DET 역할을하는 항체의 능력이다서양 말 또는 다른 심사 플랫폼에서 항체 (차 항체)를 돌출 한 칼라. 성공적인 항체는 항원 비 이온 또는 가능 온성 계면 활성제의 존재 하에서 결합 할 수 있도록 충분히 높은 친화 도로 항원을 표적으로한다. 선호도가 높은 항체 친 화성 - 숙성의 IgG 항체에 공통 있지만, 상대적으로 생화학 적 설정에서 에이전트를 검출 한 적은 시판 대한 IgM 항체가있는 이유 중 하나입니다 IgM의 이소 타입의 항체 중 덜 일반적이다. 항체의 결합 친 화성이 높은 분자 항원의 면역 침전 및 웨스턴 블로 팅을위한 요구 사항입니다. 세제 농도 또는 IP 버퍼 및 용해 버퍼에 세제의 완전한 부재를 낮추면 그 팹 도메인을 통해 낮은 친화 항체에 의해 표적 항원을 할 수 있습니다. 반대로, 그 Fc 부분을 통해 단백질 L 아가를 타겟팅하는 항체의 능력은 상당히 다른 세제 concen의 범위 아이소 타입 컨트롤 간의 영향을받지 않는다trations. 그러나, 용해 완충액 및 IP 버퍼 낮은 세제 농도는 세포막을 파괴하고 특정 분자의 분리를 방지한다. 마찬가지로, 웨스턴 블롯을 세척 버퍼에서 낮은 세제 농도 (예를 들어, PBS-T)는 낮은 친 화성 항체의 항원 결합을 허용하지만, 동시에 비특이적 결합을 증가시키고, 따라서 옵션이 아니다.

항원 단백질 코어의 존재는이 방법에 대한 또 다른 요구 사항이다. 번역 후 변형 (예를 들어, 당 단백질, 지질 단백질)와 수정되지 않은 단백질,하지만 유일한 지질 또는 탄수화물과 단백질, 웨스턴 블롯에서 검출된다. 이 세제의 존재 또는 부재 조직 또는 세포 용 해물로부터 지질 (예, 스핑 고리 피드)을 면역 침전하는 것은 불가능하다. 동시에 세제 방해 필수적하면서 세제 및 지질의 물리 화학적 특성이 선택적 지질 - 항체 상호 작용을 허용하기에 너무 비슷순서 멤브레인은 특정 분자의 선택적 분리를 허용합니다. 단백질 코어의 부재 최선 지식만을 탄수화물로 구성된 면역 침전에, 이전에보고되지 않았다. 대한 IgM 항체가 자주 반드시 단백질 장치에 연결되지 않은 탄수화물과 당지질을 대상으로하기 때문에 특히 관련된다. 다른 크로마토 그래피 기술은 단백질 코어의 부재 지질 및 탄수화물을 분리하고 면역 식별해야한다. 예를 들어, TLC 플레이트 (면역 TLC)의 후속 검출 항체와 세포 지질의 박층 크로마토 그래피 (TLC)는 ^{(51, 52)를} 실현할 수있다.

다른 항 PSA 항체는 시판 항 IgM의 PSA뿐만 아니라 HIgM12 비교 결과 이​​전 연구에 기재되어있다 (클론 2-2B). PSA의 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체는 마우스와 같은 가능한 monoc의 IgG 항체 (클론 735)는lonal 또는 토끼 폴리 클로 날 항체 ^(53). 이 안티 PSA IgG 항체는 미세 아교 세포 ^(41)를 포함하여 다른 CNS의 세포 유형에 SynCAM 및 NCAM에 PSA를 감지합니다. 항 PSA IgG 항체는 달리, 인간 IgM의 항체 HIgM12, HIgM42 및 항 PSA 마우스 IgM의 (클론 2-2B)는 마우스에서 다양한 태아 및 초기 출생 후 단계에서 SynCAM에 PSA를 타겟팅 할 수없는 (그러나 NCAM에)있다 ¹⁵ 비 polysialylated SynCAM되는 동안 쉽게 검출. 사용 IgM의 항체는 또한 미세 아교 세포 (그림 + 4 3)에 PSA를 감지 할 수 없습니다. 항체 이소 타입 사이에 관찰 된 차이에 대한 가능한 설명은 안티 PSA의 IgG에 비해 IgM의 항체의 결합을 잠재적으로 낮은 친화력으로 결합 된 PSA-NCAM의 수준에 비해 낮은 PSA-SynCAM 수준 일 수있다. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 15. E17 WT의 한배 새끼에서 HIgM12 용출 항원을 사용하여 이후의 웨스턴 블롯에 농도계에 의해 검출로 IgMs 중쇄에 비해 PSA-NCAM "를 아래로 당겨"비슷한 강도를 보여 주었다 정도로 PSA-NCAM을 면역 제어합니다. 이 결과는 대상 PSA에 HIgM12의 적어도 충분한 친 화성을 제안했다. WT의 한배 새끼는 달리 HIgM12가 NCAM KO 동물에 SynCAM에 부착 된 PSA를 감지하지 않았다 제어합니다. 동일한 결과는 인간 항 IgM의 HIgM42 PSA를 사용하여 면역 침전을 얻었다. HIgM12 및 HIgM42뿐만 아니라, 마우스 항 - PSA IgM의 (복제 2-2B)는 배아 및 출생 후의 발달 단계에서 WT와 NCAM KO 동물 서양 말에 SynCAM에 PSA를 대상으로 할 수 없습니다. 낮은 친화도가 혼자 가능성이 나타납니다 특히 ¹⁵ CNS 조직 (물론 당 0.1 μg의 CNS 조직)의 소량을 사용하여 웨스턴 블롯에서 NCAM에 부착 된 PSA를 감지 할 필요 HIgM12의 적은 양 (/ ㎖ 0.1 μg의)을 감안할 때세 가지 방법에 HIgM12에 의한 PSA-SynCAM 검출의 완전한 부족에 대한 책임.

우리는 안티 PSA 대한 IgM 항체 자주 출판 항 PSA IgG 항체 (클론 735) 사이에 상당한 차이가 있다고 결론 지었다. 시판 항 PSA 대한 IgM 항체 HIgM12 이미 다양한 질환 모델에서 효능을 입증하기 때문에 특히 흥미 롭다 antiPSA IgG 항체 (735)로 얻어진 결과를 확인하기 이전에 더 자주 사용하지 않은 이유는 분명하지 않다. 다른 안티 PSA 대한 IgM 항체가 유사한 치료 효과가있을 수 있지만 그것은 반 PSA IgG 항체 (클론 735)는 MS 및 ALS의 모델에서 비슷한 치료 결과를 가지고 있는지 확실하지 않다.

요약하면, 여기에 기재된 방법은 MS에 대한 잠재적 인 임상 시험 및 가능한 다른 신경 퇴행성 질환을 지원하는 회생 HIgM12 인간 항체의 항원을 식별하는 데 주로 사용된다. 개미의 동정생물학적 활성을 갖는 항체 igens 행동의 그들의 메커니즘을 이해하는 필수 단계입니다. 이것은 현재 인간 임상 시험의 안전성과 효능에 대해 시험되는 다수의 모노클로 날 항체의 맥락에서 특히 관련된다. 지금까지 임상 시험 대한 IgM 항체의 수가 적은 반면, 상기 항체 클래스 ^{1-10,37,40,42-45의} 치료 가능성을 강조 연구의 증가와 함께, 하이 브리 도마 기술의 최근의 진보는 새로운 또는 개발을 촉구 비 단백질 IgM의 항원을 식별 할 수정 된 방법을 적용.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	고포도당, 글루타민 포함, 피루브산 나트륨, 500ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500ml, L-글루타민, 피루브산 나트륨, 고포도
페니실린-스트렙토마이신	Life Technologies	15140-122	10,000U/ml, 100ml
N-2 보충제(100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 보충제 (50x)	Life Technologies	17504-044	무혈청, 10 ml
소 태아 세럼 - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
멸균수	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1,000 ml, 12/CA
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &미드닷; xHBr, 분자량 30,000-70,000 g/mol, 50 mg
소 혈청 알부민 분획 V	시그마	A-3294-100G	열 충격 분획, 프로테아제 무료, pH 7,  순도 98%, 100 g
D-(+)-글루코스	시그마	G5767-500G	C6H12O6, 분자량: 180.16 g/mol, ACS 시약,
소 췌장에서 추출한 트립신	Sigma	T9935-100mg	본질적으로 무염, 동결 건조 분말, 9,000 BAEE 단위/mg 단백질
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I	Sigma	D5025-150KU	Type IV, 동결 건조 분말, 2,000 Kunitz 단위/mg 단백질
재조합 쥐 FGF 기본 단백질	R& 운반	3339-FB-025	BSA, 25 µ g, 동결건조, > 95%, 16.2 kDa
재조합 쥐 PDGF-AA 단백질	R& D 시스템	1055-AA-50	캐리어 프리, 50 µ g, 동결 건조, > 97 %, E. coli< / em> 유래, 12.5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml, 글루타민 없음, 아스파르트 산 없음, 글루탐산 파라
포름 알데히드	없음 시그마	P6148-1KG	결정질, 1kg, 시약 등급, 분자량 30.03 g / mol (단량체)
Tris [hydroxymethyl] aminomethane (Tris bas	Biorad	# 1610719	1 kg, 99.8 % pure, 분말
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Biorad	# 1610302	1 kg,
분말	Glycine Fisher Scientific	BP-381-5	C 2< / sub>H 5 < / sub>NO2< / sub>, 분자량 : 75.07 g / mol, 백색 결정 분말, 5kg
염화나트륨	시그마	S7653-5KG	NaCl, 분자량 : 58.44 g / mol, 5kg
인산나트륨 일염기성	시그마	S0751-500G	NaH2PO4, 분자량: 119.98g/mol, 500g
인산염 완충 용액 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	칼슘 및 마그네슘 없음, 6 x 500ml
Falcon 60mm TC 처리 세포 배양 접시	Corning Life Sciences	#353002	60 mm 세포 배양 접시, TC 처리된 폴리스티렌, 20/팩, 멸균
Falcon 60 mm x 15 mm 페트리 접시	Corning Life Sciences	#351007	Not TC-Treated 세균 페트리 접시, 20/Pack
6 웰 세포 배양 플레이트	Corning Costar	CLS3516	6 웰, 평평한 바닥 (개별 포장), 감마선 조사, 성장 영역 9.5 c
75 cm² 조직 배양 플라스크	Corning Life Sciences	430720U	75cm² U-형 경사형 목 세포 배양 플라스크와 플러그 씰 캡
피어스&트레이드; 단백질 L 플러스 아가로스	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml, 가교 6% 구슬 아가로스(CL-6B), 결합 용량: 10 - 20 mg IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔	Biorad	456-1094	10-well, 50 µ l, Mini-PROTEAN 전기 영동 세포
Immobilon-P Membrane	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0.45 µ와 함께 사용; m, 26.5 cm x 3.75 m 롤
Anti-Polysialic Acid-NCAM 항체, 클론	Millipore	MAB5324	50 microliters, 숙주: 마우스, 단클론 IgM
4x Laemmli 시료 완충액	Biorad	#1610747	10 ml, 4x premixed protein 시료 완충액
2-메르캅토에탄올	Biorad	#1610710	25 ml, 98% 순수, 14.2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 마이크로 리터, 200 & 마이크로; g/ml, 3,500 U/mg
25 mm 유리 커버슬립	Fisher Scientific	12-545-102	서클 번호 1; 두께: 0.13 - 0.17 mm; 크기 : 25mm
HEPES 완충 용액	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml, 1 M
Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml, 칼슘, 마그네슘, 페놀 제외, 레드
파파인	Worthington Biochemical Cooperation	LS003119	동결건조 분말, 100 mg
마그네슘황산염	시그마	M-2643-500G	분말, 500 g
L-글루타민	Gibco	#25030-081	100 ml, 200 mM