Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer
Summary
Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.
Abstract
Recenti miglioramenti nella Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) sensori hanno consentito il loro uso per rilevare varie piccole molecole tra ioni e aminoacidi. Tuttavia, l'intensità innata debole segnale di sensori FRET è una sfida importante che impedisce loro applicazione in vari campi e rende l'uso di costosi, di fascia alta Fluorimetro necessario. In precedenza, abbiamo costruito un analizzatore FRET ad alte prestazioni conveniente che possono specificatamente misurare il rapporto di due bande di lunghezza d'onda di emissione (530 e 480 nm) per ottenere un'elevata sensibilità di rilevamento. Più recentemente, si è scoperto che i sensori FRET con periplasmatiche batterica proteine leganti rilevano ligandi con la massima sensibilità nel range di temperatura critica di 50 – 55 ° C. Questo rapporto descrive un protocollo per la valutazione zucchero contenuto nei campioni di bevande disponibili in commercio utilizzando il nostro analizzatore FRET portatile con un sensore FRET specifica temperatura. I nostri risultati hanno dimostrato che la scaldaprocesso del sensore FRET aumenta significativamente il segnale di rapporto FRET, per consentire la misura più accurata del contenuto di zucchero. L'analizzatore e sensore FRET su misura sono state applicate con successo per quantificare il contenuto di zucchero in tre tipi di bevande commerciali. Prevediamo che un'ulteriore riduzione dimensioni e prestazioni valorizzazione delle apparecchiature faciliterà l'utilizzo di analizzatori portatili in ambienti in cui le apparecchiature high-end non è disponibile.
Introduction
Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è stato ampiamente utilizzato come un sensore biometrico per rilevare piccole molecole quali zuccheri, ioni calcio e aminoacidi 1-4. biosensori FRET contengono proteine fluorescenti, proteine fluorescenti ciano (CFP), e le proteine fluorescenti gialli (YFPs), che si fondono ad entrambe le estremità delle proteine periplasmatiche-binding (PBP). Zuccheri legano ai PBP situati al centro del sensore FRET, provocando cambiamenti strutturali al sensore che successivamente alterare l'orientamento distanza e la transizione dipolo delle due proteine fluorescenti alle estremità del PBP. Questa modifica permette analisi quantitativa del contenuto di zucchero misurando il rapporto tra le lunghezze d'onda di emissione di EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). A causa della elevata sensibilità, specificità, capacità di monitoraggio in tempo reale, e il tempo di risposta di biosensori FRET, questi sensori sono ampiamente utilizzati in applicazioni ambientali, industriali e medicali 5. Inoltre, RaziomMisurazione etrica usando biosensori FRET ha importanti vantaggi pratici, in quanto può essere utilizzato per misurare componenti in campioni biologici complessi dove la concentrazione sensore non può essere facilmente controllata e fluorescenza di fondo è sempre presente.
Nonostante questi vantaggi dei sensori FRET-based per la visualizzazione quantitativa, piccoli cambiamenti strutturali con dominio incompleto movimento trasferimento alle proteine fluorescenti producono intensità del segnale intrinsecamente debole. Questo segnale debole limita l'applicazione di sensori FRET-based per in vitro o in vivo analisi 6. Di conseguenza, la maggior parte FRET biosensori richiedono l'uso di apparecchiature costose e altamente sensibile. In precedenza, abbiamo sviluppato un analizzatore FRET poco costoso e portatile con caratteristiche simili a quelle degli analizzatori fluorescenza esistenti 7. In questo dispositivo, economico 405 nm banda ultravioletta diodi emettitori di luce (LED) è stato utilizzato come sorgente di luce per provocare l'eccitazione del thsegnale di fluorescenza e, sostituendo una lampada costosa o laser. Il sistema di rilevamento dell'analizzatore concentra efficacemente il segnale di fluorescenza dissipazione su due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. In uno studio più recente, abbiamo dimostrato che l'ottimizzazione della temperatura di rilevamento a 50 – 55 ° C potrebbe amplificare in modo significativo il segnale raziometrico FRET 8. Questo miglioramento segnale specifico temperatura, insieme con l'analizzatore FRET misura, consente l'utilizzo di sensori FRET in applicazioni diagnostiche più generali con sensibilità rapida ed elevata.
In questo protocollo, abbiamo dimostrato l'applicabilità generale dell'analizzatore FRET in condizioni ottimali di temperatura FRET quantificando il contenuto di zucchero delle bevande disponibili in commercio. Questo protocollo fornisce i dettagli del funzionamento del dispositivo FRET, nonché una breve descrizione del sensore e preparazione del campione. Prevediamo che questa relazione promuoverà la potenziale applicazione del portatileAnalizzatore in ambienti di laboratorio su piccola scala e fornire una base per un ulteriore sviluppo di un dispositivo economico in loco diagnostica con biosensori FRET-based.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo permette quantificazione rapida ed efficiente del tenore di zucchero nei campioni bevande, utilizzando un analizzatore di FRET misura 7 ad una temperatura ottimale per sensori FRET. L'analizzatore è stato progettato con un recentemente sviluppato, poco costoso banda 405-nm ultravioletta-LED come fonte di luce e due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. Questo dispositivo è più conveniente rispetto ad altri Fluorimetro comparabili. Il dispositivo ha mostrato alta sensibilità di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Centro Intelligent biologia sintetica del progetto Frontier globale (2011-0.031.944) e il programma di iniziativa KRIBB Research.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
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