Detecção de Cortex Fragmentos Durante bacteriana germinação de esporos
Summary
Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.
Abstract
The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.
Introduction
Endospores são metabolicamente formas latentes de bactérias que permitem que as bactérias para persistir em ambientes desfavoráveis. Em muitas bactérias formadoras de esporos, a formação de esporos é induzida pela privação de nutrientes, mas este processo pode ser controlada por alterações de pH, exposição ao oxigénio ou outros stresses 1. Embora em sua forma de esporos metabolicamente dormente, as bactérias resistir à radiação UV, a dessecação, temperaturas mais elevadas e que congela 2. A maior parte do conhecimento sobre o processo de esporulação vem de estudos no organismo modelo, Bacillus subtilis. O processo de esporulação começa com a replicação do ADN e a formação de um filamento de 3,4 axial. Um septo assimétrica, em seguida, divide a célula em dois compartimentos de tamanho desigual. O compartimento maior, a célula mãe, engolfa o compartimento mais pequeno, o forespore. Tanto a célula mãe e forespore coordenar a expressão do gene para amadurecer o esporo e a célula mãe, eventualmente, lisa, liberando o Dormant de esporos para o ambiente circundante um.
A estrutura e a composição de esporos é conservada entre várias espécies bacterianas. O núcleo de esporos tem um teor de água inferior a célula vegetativa e é rica em ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante a formação de esporos, DPA é bombeado para dentro do núcleo de esporos em troca de água. Em torno do núcleo é uma membrana de esporos interior, onde, na maioria das bactérias formadoras de esporos, os receptores que reconhecem as pequenas moléculas que estimulam a germinação (germinants) estão localizados a 2. Localizado no exterior membrana interna do esporo é uma camada de peptidoglicano da parede celular. Uma camada de peptidoglicano especializado (córtex) rodeia o peptidoglicano da parede celular e é composta de muitos dos mesmos componentes como peptidoglicano da parede celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM)]. No entanto, aproximadamente 50% dos resíduos de NAM no córtex foram convertidos para murâmico-δ-lactama 5,6 </s-se>. Durante a germinação de esporos, estes resíduos murâmico-δ-lactâmicos são reconhecidos pelos esporos do córtex enzimas líticas (SCLEs), permitindo assim que o córtex para ser degradada (um processo essencial para completar a germinação) mas não a parede celular. Rodeando o córtex é uma membrana exterior e várias camadas de proteínas de revestimento 2.
Controlando o processo de germinação é criticamente importante para as bactérias formadoras de esporos. A germinação é iniciada quando os receptores germinativa interagir com seus respectivos germinants 2. Em muitas bactérias formadoras de esporos, estes são germinants amino ácidos, açúcares, nucleótidos, iões, ou combinações destes dois. C. difficile germinação de esporos é iniciada por meio de combinações de certos ácidos biliares, [por exemplo, ácido taurocólico (TA)] e aminoácidos (por exemplo, glicina) 7-10. Embora existam diferenças entre o C. via de germinação difficile e as vias estudadas em outra forma de esporobactérias, tais como B. subtilis, comum a todos é a exigência absoluta para degradar o córtex esporos para permitir que uma célula vegetativa a crescer a partir do esporos germinados 2,8. Córtex degradação pode ser conseguida pela SCLEs CwlJ / SleB (como encontrado em B. subtilis) ou SLEC (como encontrado em muitos Clostridia). hidrólise córtex reduz a restrição na parede da célula e esporo. Isto permite uma re-hidratação completa do núcleo, um passo necessário para a reactivação muitas das proteínas necessárias para o metabolismo celular 2.
Quando esporos germinam, as mudanças de esporos a partir de um estado dormente de fase brilhante para um estado de fase-escuro e este processo pode ser medido por uma alteração na densidade óptica (DO) a 600 nm 11. Um relatório anterior sugere que grande parte dessa mudança de OD é devido à liberação da DPA do esporo 12. Durante a nossa recente estudo, buscou-se comparar o tempo de C. difficile germinação de esporos e acompanhou olançamento do DPA e córtex fragmentos 9. Para este estudo foi fundamental para monitorar o lançamento de fragmentos de córtex, quando começaram a ser lançado pela germinação de esporos.
O ensaio colorimétrico aqui utilizado baseou-se num método para a detecção de açúcares com extremidades redutoras desenvolvido Ghuysen et ai. 13. Porque os outros têm descrito protocolos para a detecção de açúcares redutores 14 ou modificou os protocolos 15, a literatura sobre este assunto pode ser confuso. Aqui, nós detalhe um método passo-a-passo para a detecção colorimétrica de açúcares redutores libertados de germinação C. esporos difficile. Embora este estudo utiliza C. esporos difficile, os açúcares redutores libertados durante a germinação de esporos a partir de outras bactérias formadoras de esporos são capazes de serem detectadas com este protocolo 9,16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Após estimulação, os esporos submetidos ao processo de germinação perder as suas propriedades de resistência, sem a necessidade de síntese macromolecular. Quando a germinação de esporos é acionado, o núcleo de esporos libera DPA em troca de água 2. Devido ao elevado teor de DPA do esporo dormente, o núcleo é de esporos sob intensa pressão osmótica e o peptidoglicano especializado, córtex, ajuda a impedir que o núcleo de inchaço, agindo, presumivelmente, como uma barreira para a expansão <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O Projeto descrito é suportado pelo Prêmio Número 5R01AI116895 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas ou o National Institutes of Health.
Materials
| 2.0 mL screw cap tube | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p200 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| p20 eppendorf pippet | Eppendorf | ||
| 100-1250uL pipet tips | VWR | 89079-486 | |
| 1-200uL pipet tips | VWR | 89079-458 | |
| N-acetyl-D-glucosamine | Sigma | A3286-25G | |
| Hydrochloric Acid – 10N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Acetic Anhydride | Alfa Aesar | L04295 | |
| Sodium Bicarbonate | BDH | BDH0280-500G | |
| Potassium Tetraborate tetrahydrate | Alfa Aesar | 39435 | |
| Sodium Hydroxide | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma | 156477-100G | |
| Saturated Phenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-Mercaptoethanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| Acetic Acid, Glacial | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Heated, Circulating Water Bath | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 well clear tissue culture plates |
| Culture tubes | VWR | 89000-506 | |
| Lyophilizer | |||
| Heat Blocks | |||
| Vortex Machine | |||
References
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).
- Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. Spore formation in Bacillus subtilis. Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).
- Fimlaid, K. A., Shen, A. Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes. Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).
- Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).
- Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores. J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).
- Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins. Trends Microbiol. 22 (7), (2014).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination. J Bacteriol. 197 (14), (2015).
- Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection. PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).
- Moir, A., Smith, D. A. The Genetics of bacterial spore germination. Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).
- Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores. Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).
- Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. Enzymes that degrade bacterial cell walls. Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).
- Park, J. T., Johnson, M. J. A submicrodetermination of glucose. J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).
- Thompson, J. S., Shockman, G. D. A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls. Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).
- Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens. J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).
- Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate. Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).
- Hindle, A. A., Hall, E. A. Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection. The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).
- Kort, R., et al. Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release. Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).
- Elson, L. A., Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).
- Ramirez, N., Abel-Santos, E. Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro. J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).
- Akoachere, M., et al. Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination. J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).
- Duncan, C. L., Strong, D. H. Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens. Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).
- Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores. J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).
- Meador-Parton, J., Popham, D. L. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).
- Lambert, E. A., Popham, D. L. The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization. J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).
- Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy. J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).
