Hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPC) stammer fra specialiserede (hemogenic) endotelceller under udvikling, men alligevel lidt om den proces, hvorved nogle endotelceller angiver at blive bloddannende. Vi demonstrerer et flow-cytometri metode tillader samtidig isolering af hemogenic endothelceller og HSPC fra murine embryonale væv.
Specifikationen af hemogenic endotelceller fra embryonale vaskulær endotel opstår under korte udviklingsmæssige perioder inden for forskellige væv, og er nødvendig for fremkomsten af definitive HSPC fra murine ekstra embryonale blommesækken, placenta, navlestrengen fartøjer, og de embryonale aorta-gonade-mesonephros ( AGM) region. Den forbigående natur og lille størrelse af denne celle population gør sin reproducerbar isolation for omhyggelig kvantificering og eksperimentelle applikationer teknisk vanskeligt. Vi har etableret en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -baseret protokol til samtidig isolering af hemogenic endothelceller og HSPC under deres højeste generationstider i blommesækken og AGM. Vi demonstrerer metoder til dissektion af blommesækken og AGM væv fra mus embryoner, og vi præsenterer optimeret væv fordøjelse og antistofkonjugering betingelser for maksimal celle overlevelse forud for identifikation og genfinding via FACS. Repræsentant FACS analysis plots er vist, at identificere den hemogenic endothelcelle og HSPC fænotyper, og beskrive en methylcellulose-baserede assay til evaluering deres blod danner potentiale på en klonal niveau.
En funktionel kredsløbssygdomme kræver en parallel udvikling af blodkar og blodceller. På de tidligste stadier af blod udvikling (primitive hæmatopoiese), forbliver oprindelsen af erytroblaster kraftigt debatteret en. I modsætning til senere stadier af blodceller udvikling (endelig hæmatopoiese), er det blevet mere og mere klart, at multi-slægt HSPC skyldes specialiserede vaskulære endotelceller, der erhverver bloddannende potentielle (hemogenic endotelceller) inden blommesækken, placenta og AGM 2-5, samt i vitelline og umbilical fartøjer, den embryoniske endocardium 6, og hoved vaskulatur 7. Specifikationen af hemogenic endotelceller inden for disse forskellige væv sker på bestemte stadier af udvikling; for eksempel inden blommesækken på ~ E8.25 og inden for AGM på ~ E10 8-12. Ikke desto mindre, selv under disse specifikke udviklingsmæssige vinduer, befolkningen i hemogenic endothelial celler udgør en lille brøkdel af alle endotelceller (1 – 3% af blommesækken og AGM endotelceller) 11,12. Processen med hemogenic endotelcelle "specifikation" er kritisk for murine, såvel som den menneskelige, hæmatopoiese. Hæmatopoietiske celler er blevet vist at bud fra endotelet i blommesækken fartøjer og aorta i humane embryoner 13, og flere laboratorier har vist, at blodlegemer fra humane pluripotente stamceller kræver en endotelcelle mellemprodukt 14-16. Således definerer fænotypen af murine hemogenic endotelceller og forstå de molekylære begivenheder, der fører til deres udvikling i denne dyremodel skulle lette udøvelse af in vitro teknologi til generering af hemogenic endotelceller fra humane pluripotente stamceller. Til gengæld eventuel udvikling af en metode til storstilet generation af differentierede blod celletyper fra multi-slægt HSPC – selv Deriaba fra humane pluripotente stamceller via en fysiologisk relevant hemogenic endotelceller mellemliggende – ville have utrolig terapeutisk potentiale for hæmatologisk, onkologisk og regenerativ medicin. Mod dette mål har vi defineret fænotype hemogenic endotelceller, på en klonal niveau, inden det murine blommesækken 11 og AGM 12, to store websteder af endelig HSPC produktion under embryogenese. Ligesom HSPC inden voksen knoglemarv 17, embryonale hemogenic endotelceller og HSPC udviser Hoechst dye efflux egenskaber og derfor møde inden for den "side population" (SP) af celler på en FACS plot 5,11,12 (som vist i figur 3). Derudover har vi også vist, at hemogenic endotelceller udtrykker markører for både endotel og stamceller (Flk1 og cKit, henholdsvis), men udtrykker ikke en hæmatopoietisk linje markering, CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller være identficeret og isoleret ved FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, og vi har vist, at disse celler giver anledning til HSPC indeholdt i Flk1- / cKit + / CD45 + SP brøkdel af blommesækken og AGM celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identificeres og isoleres fra blommesækken eller AGM væv høstet fra enten frisk aflivede embryoner, eller fra embryoner dyrket i op til 48 timer i ex vivo embryo kultur (som afbildet i figur 1). Ex vivo kultur tillader selektiv forbehandling af individuelle embryoer med farmakologiske midler, og giver også mulighed for kortvarig ekspression af ønskede transgener (dvs. efter lentiviral transduktion). FACS identifikation af hemogenic endotelceller og HSPC ved den heri beskrevne fremgangsmåde kan anvendes som et kvantitativt mål for endelig hæmatopoietisk udvikling i genetisk manipulerede musemodeller; cellerne kan også hentes til efterfølgende eksperimentelle applikationer, herunder blod-forming assays, ekspressionsanalyse og transplantation.
Animal Emner: Bruger og etiske overvejelser
En voksende mængde litteratur har etableret det vigtige bidrag fra hemogenic endotelceller til HSPC dannelse under den endelige hæmatopoiese fase af fosterudviklingen. Alligevel forbliver de fysiologiske forhold og signaler, som fremmer specifikation af en subpopulation af endotelceller mod en hemogenic skæbne dårligt forstået, og derfor endnu ikke kan efterlignes i et in vitro indstilling. Faktisk er de, der er beskrevet i dette papir teknikker er i øjeblikket i brug af vores laboratorium og andre grupper for at forbedre feltets forståelse af hematovascular udvikling, således at måske en dag blive udviklet en tilgang til ex vivo hemogenic endotelceller specifikation og HSPC produktion. Indtil Men feltet er fortsat afhængige af primære væv fra vildtype (og gentisk modificerede) musefostre at få specificeret hemogenic endotelceller og HSPC til yderligere undersøgelse. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identificeres pålideligt, og isoleret fra enten E8.5 (10 – 12 somit par) blommesækken eller E10.5 (35 – 40 somit par) AGM 11,12. På grund af den relative knaphed på hemogenic endotelceller (typisk svarende til 1 – 3% af de samlede endotelceller 11,12 indenfor disse væv) pooling af væv fra flere (~ 8 – 10) søskende i en enkelt prøve anbefales kraftigt for at opnå tilstrækkelige celler til efterfølgende eksperimenter. Kontrol af, at hemogenic endotelceller og HSPC succes er blevet identificeret og isoleret kan opnås ved dyrkning af udtagne celler under betingelser, der inducerer hæmatopoietisk differentiering. Under disse betingelser vil hemogenic endothelceller og HSPC udviser multi-slægt hæmatopoietisk differentiering, hvilket resulterer i fremkomsten af kolonier indeholdende erythroid progenitorer (BFU-E), granulocyt og makrofag progenitorer (CFU-GM) og granulocyt, erythrocyt, makrofag, megakaryocyt progenitor kolonier (CFU-GEMM).
Der er stadig mange ubesvarede spørgsmål inden for hematovascular udvikling – et område, der stadig er i sin vorden på grund af de tekniske vanskeligheder forbundet med at studere forbigående og små cellepopulationer, der dukker kun under særlige udviklingsbehov vinduer. De teknikker skitseret ovenfor forbedre mange af disse vanskeligheder ved at tillade isolering af selv enkelte celler fra hemogenic endotelceller og HSPC befolkninger i embryonale væv på kritiske udviklingsmæssige tidspunkter ved hjælp af reagenser og udstyr, der typisk findes i de fleste laboratorier. Vores protokol giver også mulighed for parallel isolation af ikke-hemogenic endotheliale cellefraktioner fra YS og AGM, der kan anvendes til uafhængige analyser, eller som kontroller for hemogenic endotelcelle fraktion i efterfølgende analyser.
Et centralt punkt i isoleringen af de hemogenic endotelceller ved hjælp af denne flerfarvet FACS-baserede metode er hensigtsmæssig spektrale compensation og præcis tegning af ensfarvede porte. Som sådan, anbefales det kraftigt, at ufarvede og ensfarvede kontroller inkluderes i alle eksperimentelle kørsler, og at de – sammen med prøver behandlet med isotype-matchede kontrol antistoffer – anvendes til at begynde med at etablere en ordentlig spektral kompensation og tegning af porte. Men ikke-specifik farvning er minimal ved denne protokol, således ufarvede og ensfarvede kontroller er tilstrækkelige til rutinemæssig kontrol af porte, når FACS sorteringsanlæg indstillinger er blevet optimeret.
Unøjagtigt trukket SP porte er en særlig bekymring med tilgangen er beskrevet i denne rapport. Tidligere undersøgelser har vist, at multipotente stamceller udviser præferentiel udstrømning af Hoechst rød 17, der danner den fysiologiske basis for deres udseende i SP ved FACS. Vi har vist, at hemogenic endotelceller og HSPC er tilsvarende inden SP cellefraktion 5,11. Lægemidler såsom calcium kanal ihibitor Verapamil blokerer denne Hoechst farvestof efflux adfærd i SP celler via blokering af en række transmembrane multiresistens transportører. I hæmatopoietiske stamceller og stamceller, dette sker primært via ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Typisk verapamil inducerer> 50% blokering af SP, men har vist den samlede grad af Hoechst efflux og efterfølgende blokering af Verapamil ses at være påvirket af udviklingsmæssig timing, formodentlig på grund af skiftende ekspression af multiple multilægemiddelresistente transportproteiner typer med differentiale Hoechst efflux evne, og følsomhed over for Verapamil 5. Det er således anbefales, stærkt, at Verapamil-behandlet Hoechst-farvet negativ kontrol skal standardmæssigt inkluderet for at sikre korrekt SP gating: Hvis en SP gate er formelt korrekt, skal registreres en bemærkelsesværdig reduktion i antallet af SP celler i prøver farvet med Hoechst i tilstedeværelsen af verapamil.
Vi har tidligere vist, at sorteretSP-celler fra E9.5 murine blommesækken har en ca. 80 – 90 gange større evne til at generere HSPC i methylcellulose-baserede hæmatopoietisk kultur, når sammenlignet med en matchet antal E9.5 ufraktioneret, ikke-Hoechst farvede hele YS vævsceller 5. Yderligere karakterisering af SP har vist, at i den murine blommesækken under tidlig hæmatopoietisk og vaskulær udvikling på E8.0, der er mærkbar ekspression af VE-cadherin og FLK-1, men lav ekspression af stamceller (c-Kit) og hæmatopoietiske markører (CD45). Således i denne udviklingsfase tidspunkterne, ur (ikke-hemogenic) EF, defineret som FLK-1 + / CD31 + / CD45- non SP celler dominerer. Dette udtryk profil skifter som endotel markør udtryk falder og CD45 og c-Kit ekspression øges, samtidig med en stigende evne til at generere HSPC in vitro mellem E9.5 og E11.5 5. Dette tyder hæmatopoietisk aktivitet af YS væv er indeholdt i SP, bliver tydeligst mellem E9.5 og E11.5, og occurring gennem en tidsindstillet tab af endotel karakteristika og gradvis erhvervelse af hæmatopoietisk kapacitet. Som sådan ekspression af de multilægemiddelresistens transportører, der giver anledning til SP fænotype er en vigtig fænotypisk markør for hemogenic endotel 5; Faktisk behøver ikke-SP celler fra AGM ikke udviser bloddannende potentiale 12. vellykket isolering af SP via Hoechst-farvning i både YS og AGM sikrer således, at celler vil blive sorteret fra den hæmatopoietiske stamceller ved en givet væv, og efterfølgende antistof farvning af celler i denne fraktion vil tillade diskrimination af hemogenic (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populationer 5,11,12. Endvidere har det været tidligere bemærket, at CD41 + celler i SP af blommesækken og AGM væv er i stand til multi-slægt kolonidannelse i methylcellulose baseret kultur 11,12. Vi definerer hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP celles ved hjælp af CD45 som en udpeget markør for hæmatopoietisk afstamning snarere end CD41 givet vores konstatering af, at ekspressionen af Flk1 og CD45 er næsten udelukker hinanden 5,11. Dette giver en ren isolation af celler i SP, der har både endotel (FLK-1) og spindel egenskaber (c-Kit) er nødvendige til endotel til hæmatopoietisk overgang men som endnu ikke har undergået denne ændring, som bestemt ved fravær af CD45 i disse celler. Det ville være nyttigt at overveje sub-fraktionering af HSPC befolkning, defineret som FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / SP celler, i Csf1r + (væv makrofag) og Csf1r- (HSC) fraktion som for nylig rapporteret af Gomez og kolleger 25, da dette ville give større opløsning af den sande HSPC versus væv makrofag progenitorpopulationer, men dette bør ikke påvirke integriteten af hemogenic endothelcelle fraktion, hvis isolation vi har skitseret siden Csf1r er en markør for makrofag progenitorer 26.
HemogENIC endotelceller er en sjælden subpopulation i både YS og AGM (omfattende 1 – 3% af endotelceller), og derfor en stor udfordring i deres undersøgelse er utilstrækkelig celle udbytte for efterfølgende ansøgninger. Denne protokol normalt resulterer i 70-80% af cellerne resterende levedygtige på tidspunktet for sortering, og en typisk hemogenic endotelcelle slags fra poolede væv opnået fra talrige fostre kan give kun få hundrede celler selv under optimale betingelser med kun 10-20% for udtagne celler indlejret i methylcellulose producerende kolonier. For at maksimere sorterede celle nummer, anbefales det kraftigt, at efterforskerne tager skridt til at sikre væv og cellernes levedygtighed gennem alle trin i proceduren: væv bør hurtigt dissekeret og samlet, og prøver skal opbevares på is når det er muligt. Prøverne bør være forberedt frisk umiddelbart før FACS sortering, og sorteret i indsamling rør indeholdende højt serum indhold, eller direkte i methylcellulose kultur som beskriverd ovenfor. Hvis levedygtighed fortsat problemer, opsamlingsrør kan også være præ-coatet med serum for yderligere at forbedre sorterede celleoverlevelse. Hvis hemogenic endotelcelle udbytte er fortsat lav, kan voksen knoglemarv eller kommercielt tilgængelige fluorofor-konjugerede perler anvendes til spektral godtgørelse for de embryonale vævsafledte enkelt farveindstillinger beskrevet heri. Hvis sorterede celler er beregnet til kultur, bør hemogenic endotelceller og HSPC sorteres direkte i vævsdyrkningsbrønde. Hvis sorterede celler er beregnet til DNA eller RNA-relateret genekspression analyse, hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller og HSPC kan sorteres direkte i opsamlingsrør indeholdende prøve lyseringspuffer at minimere celletab.
Den skitserede teknik tillader vellykket (og samtidig) isolering af hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller, samt HSPC og modne blodlegemer fraktioner fra samme embryoniske væv. Denne tilgang muliggør yderligere study af de molekylære fundament for de kritiske overgange, der opstår som endotelceller genererer blod. Erfaringer fra disse udviklingsmæssige undersøgelser kan derefter anvendes til at optimere genereringen af humane hemogenic endothelceller og HSPC afkom fra pluripotente, og potentielt autologe stamceller til behandling af fremherskende hæmatopoietiske lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |