Hematopoietiska stam- och progenitorceller (HSPC) härrör från specialiserade (hemogenic) endotelceller under utveckling, men lite är känt om den process genom vilken en del endotelceller anger att bli blodbildande. Vi visar en flödescytometri baserad metod tillåter samtidig isolering av hemogenic endotelceller och HSPC från murina embryonala vävnader.
Specifikationen av hemogenic endotelceller från embryonala kärlendotel sker under korta utvecklingsperioder inom olika vävnader, och är nödvändig för uppkomsten av slutgiltiga HSPC från mus extra embryonala gulesäcken, placenta, navel fartyg och embryonala aorta-gonad-mesonephros ( AGM) regionen. Den övergående natur och små storleken på denna cellpopulation gör sin reproducerbar isolering för noggrann kvantifiering och experimentella applikationer tekniskt svårt. Vi har etablerat en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) -baserad protokoll för samtidig isolering av hemogenic endotelceller och HSPC under sin topp generationstider i gulesäcken och årsstämma. Vi visar metoder för dissektion av gulesäcken och AGM vävnader från musembryon, och vi presenterar optimerade vävnad matsmältningen och antikroppkonjugering förutsättningar för maximal cellöverlevnad före identifiering och hämtning via FACS. Representativa FACS analys tomter visat att identifiera hemogenic endotelceller och HSPC fenotyper, och beskriva en metylcellulosa-baserad analys för att utvärdera deras blodbildande potential på en klonal nivå.
Ett funktionellt cirkulationssystemet kräver en parallell utveckling av blodkärl och blodceller. Vid de tidigaste stadierna av utveckling blod (primitiva blodbildningen), förblir ursprung erytroblaster kraftigt diskuteras en. I motsats, i senare skeden av blodkroppar utveckling (definitiv hematopoes), har det blivit allt tydligare att flera härstamning HSPC uppstå från specialiserade vaskulära endotelceller som förvärvar blodbildande potential (hemogenic endotelceller) i gulesäcken, placenta och AGM 2-5, liksom i vitelline och navel fartyg, embryonala endokardiet 6, och huvud kärl 7. Specifikationen av hemogenic endotelceller inom dessa olika vävnader sker vid specifika utvecklingsstadier; till exempel inom gulesäcken vid ~ E8.25 och inom bolaget under ~ E10 8-12. Men även under dessa särskilda utvecklings fönster, befolkningen i hemogenic Endothelial celler utgör en liten andel av alla endotelceller (1 – 3% av gulesäcken och AGM endotelceller) 11,12. Processen för hemogenic endotelceller "specifikation" är avgörande för mus, liksom människa, blodbildningen. Hematopoietiska celler har visat sig knoppas från endotelet i gulesäcken fartyg och aorta i humana embryon 13, och flera laboratorier har visat att blodkroppar från humana pluripotenta stamceller kräver en endotelcell intermediär 14-16. Sålunda definierar fenotypen av murina hemogenic endotelceller och förstå de molekylära händelser som leder till deras utveckling i denna djurmodell bör underlätta utövandet av in vitro-tekniker för generering av hemogenic endotelceller från humana pluripotenta stamceller. I sin tur, en eventuell utveckling av en metod för storskalig produktion av differentierade blodcelltyper från flera härstamning HSPC – själva Derived från humana pluripotenta stamceller via en fysiologiskt relevant hemogenic endotelceller mellan – skulle ha otrolig terapeutisk potential för hematologiska, onkologiska och regenerativ medicin. Mot detta mål har vi definierat fenotypen av hemogenic endotelceller, på en klon nivå, inom den murina gulesäcken 11 och AGM 12, två viktiga platser för slutgiltig HSPC produktion under embryogenes. Liknande HSPC inom vuxen benmärg 17, embryonala hemogenic endotelceller och HSPC uppvisar Hoechst färgämne utflödes egenskaper och därför visas inom "sida befolkningen" (SP) av celler på en FACS plot 5,11,12 (såsom visas i figur 3). Dessutom har vi också visat att hemogenic endotelceller uttrycker markörer av både endoteliala och stamceller (Flk1 och ckit, respektive), men uttrycker inte den hematopoetiska härstamningen markör, CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller vara identified och isoleras genom FACS såsom Flk1 + / ckit + / CD45- SP-celler, och vi har visat att dessa celler ger upphov till HSPC som finns i Flk1- / ckit + / CD45 + SP fraktion av gulesäcken och AGM-celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller och HSPC kan identifieras och isoleras från gulesäcken eller AGM vävnader skördas från antingen nyligen euthanized embryon, eller från embryon odlade i upp till 48 timmar i ex vivo embryoodling (såsom visas i figur 1). Ex vivo kultur tillåter selektiv förbehandling av individuella embryon med farmakologiska medel, och tillåter också för övergående uttryck av önskade transgener (dvs genom lentivirala transduktion). FACS identifiering av hemogenic endotelceller och HSPC genom metoden beskriven häri kan användas som ett kvantitativt mått på definitiv hematopoetisk utveckling i genetiskt manipulerade musmodeller; cellerna kan även hämtas för efterföljande experimentella applikationer, inklusive blod-forming analyser, expressionsanalys, och transplantation.
Djur Ämnen: Använder och etiska överväganden
En växande mängd litteratur har etablerat viktiga bidrag hemogenic endotelceller till HSPC formation under slutgiltiga hematopoies skede av embryonal utveckling. Ändå förblir fysiologiska förhållanden och signaler som främjar specificering av en subpopulation av endotelceller mot en hemogenic öde dåligt förstått, och därför ännu inte kan efterliknas i en miljö in vitro. Faktum är att de tekniker som beskrivs i detta dokument finns för närvarande används av vårt labb och andra grupper för att förbättra fältets förståelse för hematovascular utveckling, så att en strategi för ex vivo hemogenic endotelceller specifikation och HSPC produktion skulle en dag kunna utvecklas. Fram till dess, men fältet är fortfarande beroende av primära vävnader från vild-typ (och genentiskt modifierade) musembryon för att erhålla specificerad hemogenic endotelceller och HSPC för vidare studier. Hemogenic endotelceller och HSPC tillförlitligt kan identifieras och isoleras från antingen E8.5 (10 – 12 somit par) gulesäcken eller E10.5 (35 – 40 somit par) årsstämma 11,12. På grund av den relativa bristen på hemogenic endotelceller (typiskt representerar 1-3% av den totala endotelceller 11,12 inom dessa vävnader) gemensamt utnyttjande av vävnader från flera (~ 8 – 10) kullsyskon till ett enda prov rekommenderas för att erhålla tillräckliga celler för efterföljande experimentering. Verifiering av att hemogenic endotelceller och HSPC har framgångsrikt identifierats och isolerats kan åstadkommas genom odling av återvunna celler under förhållanden som inducerar hematopoetisk differentiering. Under dessa betingelser, kommer hemogenic endotelceller och HSPC uppvisar flera härstamning hematopoetisk differentiering, vilket resulterar i uppkomsten av kolonier innehållande erythroid progenitorceller (BFU-E), granulocyt och makrofager föregångare (CFU-GM), och granulocyt, erytrocyt, makrofager, megakaryocyter gångar kolonier (CFU-GEMM).
Det finns fortfarande många obesvarade frågor när det gäller hematovascular utveckling – ett område som fortfarande är i sin linda på grund av de tekniska svårigheterna att studera övergående och små cellpopulationer som uppstår endast under särskilda utvecklings fönster. De tekniker som beskrivs ovan lindra många av dessa svårigheter genom att medge isolering av även enstaka celler från hemogenic endotelceller och HSPC populationer i embryonala vävnader vid kritiska utvecklings tidpunkter med användning av reagens och utrustning som normalt finns i de flesta laboratorier. Våra protokoll möjliggör också parallell isolering av icke-hemogenic endotelceller cellfraktioner från YS och AGM, som kan användas för oberoende analyser eller som kontroller för hemogenic endotelceller fraktionen i efterföljande analyser.
En viktig punkt i isolering av hemogenic endotelceller med hjälp av denna multi FACS-baserad metod är lämplig spektral compensation och exakt ritning av enfärgade grindar. Som sådan, är det starkt rekommenderat att ofärgade och enfärgade kontroller ingå i alla experimentella försök, och att de – tillsammans med prover som behandlats med isotyp-matchade kontrollantikroppar – användas för att initialt fastställa korrekt spektral ersättning och ritning av grindar. Emellertid är icke-specifik färgning minimal i detta protokoll, alltså ofärgade och enfärgade kontroller är tillräckliga för rutinkontroll av grindar gång FACS sorteringsinställningar har optimerats.
Felaktigt dragna SP grindar är ett särskilt bekymmer med det tillvägagångssätt som beskrivs i denna rapport. Tidigare studier har visat att multipotenta stamceller uppvisar förmånliga utflöde av Hoechst röd 17, som bildar den fysiologiska grunden för deras utseende i SP genom FACS. Vi har visat att hemogenic endotelceller och HSPC är på liknande sätt inom SP cellfraktionen 5,11. Läkemedel såsom kalciumkanalen ihibitor Verapamil blockerar denna Hoechst färgämne efflux beteende SP celler via blockering av en mängd olika transmultiresistens transportörer. I hematopoetiska stam- och progenitorceller, sker detta i första hand via ABCG2 / BCRP1 transportör 24. Typiskt verapamil inducerar> 50% blockering av SP, men den totala graden av Hoechst utflöde och dess efterföljande blockering av Verapamil sett har visat sig påverkas av utvecklings timing, förmodligen på grund av förändrade uttryck av flera multiresistenta transportörtyper med differentiell Hoechst utflödesförmåga och känslighet för Verapamil 5. Således är det starkt rekommenderas att Verapamil behandlade Hoechst-färgade negativ kontroll vara standardmässigt inkluderas för att säkerställa korrekt SP grind: Om en SP grind är korrekt utformat, bör en märkbar minskning av antalet SP celler detekteras i prover färgade med Hoechst i närvaro av Verapamil.
Vi har tidigare visat att sorterasSP-celler från E9.5 murina gulesäcken har en ~ 80-90 gånger större förmåga att generera HSPC i metylcellulosa-baserade hematopoetisk odling jämfört med en matchad antal E9.5 ofraktionerat, icke-Hoechst färgade hela YS vävnadsceller 5. Ytterligare karakterisering av SP har visat att den murina gulesäcken under tidig hematopoetisk och vaskulär utveckling på E8.0, det är märkbar uttryck av VE-cadherin och Flk-1, men låg expression av spindeln (c-Kit) och hematopoetiska markörer (CD45). Således, i denna utvecklings tidpunkt, primordial (icke-hemogenic) EG, definierad som Flk-1 + / CD31 + / CD45- icke SP celler dominerar. Detta uttryck profil förändringar som endotel markör uttryck minskar och CD45 och c-Kit uttryck ökar, samtidigt med en ökande förmåga att generera HSPC in vitro mellan E9.5 och E11.5 5. Detta tyder på hematopoetisk aktivitet YS vävnad som finns i SP, blir tydligast mellan E9.5 och E11.5 och occurrning genom en tidsförlust endotelceller egenskaper och gradvis förvärvet av hematopoetisk kapacitet. Som sådan, uttryck av de multiläkemedelsresistens transportörer som ger upphov till SP-fenotypen är en viktig fenotypisk markör för hemogenic endotel 5; i själva verket har icke-SP-celler från årsstämman inte uppvisar blodbildande potential 12. Således, framgångsrik isolering av SP via Hoechst färgning i både YS och AGM säkerställer att cellerna ska sorteras från hematopoetisk stamcellstransplantation facket i en given vävnad och efterföljande färgning av celler antikropp i denna fraktion kommer att tillåta diskriminering av hemogenic (Fik -1 + / c-kit + / CD45-) kontra HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populationer 5,11,12. Vidare har det varit tidigare konstaterat att CD41 + -celler inom SP av gulesäcken och AGM vävnader är i stånd att flera härstamning kolonibildning i metylcellulosa baserad kultur 11,12. Vi definierar hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP cells med hjälp av CD45 som en utsedd markör för hematopoetisk härstamning snarare än CD41 med tanke på vår finna att uttryck av Flk1 och CD45 är praktiskt taget utesluter 5,11. Detta möjliggör en ren isolering av celler i SP som har både endotel (Flk-1) och stam egenskaper (c-Kit) som är nödvändiga för endotel till hematopoetisk övergång men som ännu inte har genomgått denna förändring, som bestäms av frånvaron av CD45 i dessa celler. Det skulle vara lämpligt att överväga underfraktionering av HSPC befolkningen, definierad som Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP-celler, i Csf1r + (vävnadsmakrofager) och Csf1r- (HSC) fraktion som nyligen rapporterades av Gomez och kollegor 25, eftersom detta skulle ge större upplösning av den sanna HSPC mot vävnadsmakrofager föregångarpopulationer, men detta bör inte påverka integriteten för hemogenic endotelcell fraktion vars isolering vi har beskrivit sedan Csf1r är en markör för macrophage stamceller 26.
HemogENIC endotelceller är en sällsynt subpopulation i både YS och AGM (bestående av 1-3% av endotelceller), och därför en stor utmaning i sin studie är otillräcklig cellutbyte för senare ansökningar. Detta protokoll resulterar vanligen i 70-80% av cellerna återstående livsdugliga vid tiden för sortering och en typisk hemogenic endotelceller sort från poolade vävnader som erhållits från flera embryon kan ge endast ett par hundra celler även under optimala förhållanden med endast 10-20% för tillvaratagna cellerna inbäddade i metylcellulosa producerande kolonier. För att maximera sorterade cellantal, rekommenderas det starkt att utredarna vidta åtgärder för att säkerställa vävnad och cellviabilitet under varje steg av förfarandet: vävnader bör snabbt dissekeras och slogs samman och prover bör hållas på is när det är möjligt. Prover bör beredas på nytt omedelbart före FACS sortering, och sorteras i insamlings rör innehållande höga seruminnehåll eller direkt i metylcellulosa kultur som beskriverd ovan. Om lönsamhetsproblem kvarstår, uppsamlingsrör kan också i förväg belagd med serum för att ytterligare förbättra sorterade cellöverlevnad. Om hemogenic endotelceller avkastning är fortfarande låg, kan vuxen benmärg eller kommersiellt tillgängliga fluoroforen-konjugerade pärlor användas för spektral ersättning i stället för de embryonala vävnads härrör enda färgkontroller som beskrivs häri. Om sorterade celler är avsedda för kultur, bör hemogenic endotelceller och HSPC sorteras direkt i vävnadsodlingsbrunnar. Om sorterade celler är avsedda för DNA eller RNA relaterade genexpressionsanalys, hemogenic och icke-hemogenic endotelceller och HSPC kan sorteras direkt i uppsamlingsrören innehållande prov lysbuffert för att minimera cellförlust.
Den skisserade tekniken medger framgångsrik (och samtidigt) isolering av hemogenic och icke-hemogenic endotelceller, liksom HSPC och mogna blodcellfraktioner från samma embryonala vävnader. På så sätt kan ytterligare study av de molekylära grunderna för de kritiska övergångar som uppstår endotelceller genererar blod. Insikter från dessa utvecklingsstudier kan sedan användas för att optimera genereringen av humana hemogenic endotelceller och HSPC avkomma från pluripotenta, och potentiellt autologa stamceller för behandling av förekommande hematopoetiska störningar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |