Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.
embriyonik vasküler endotel hemogenic endotel hücrelerinin özellikleri farklı dokulardaki kısa gelişim dönemlerinde oluşur ve (fare ekstra embriyonik yolk kesesi, plasenta, göbek damarları ve embriyonik aorta-gonad-mesonephros gelen kesin HSPC ortaya çıkması için gerekli olan AGM) bölgesi. Bu hücre popülasyonunun geçici doğası ve küçük boyutlu dikkatli ölçümü ve deneysel uygulamalar için tekrarlanabilir izolasyon teknik olarak zor hale getirir. Bu yumurta sarısının ve AGM bölgesindeki pik üretim zamanlarda hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu için bir floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı protokol kurduk. Biz yolk kesesi ve fare embriyoları AGM dokuların diseksiyonu için yöntemler göstermek ve biz önce FACS yoluyla belirlenmesi ve alımı için maksimum hücrenin hayatta kalması için optimize doku sindirim ve antikor konjugasyon koşullarını sunuyoruz. Temsilcisi FACS analizis araziler bu hemogenic endotelyal hücre ve HSPC fenotipleri belirlemek ve klonal düzeyde kendi kan yapıcı potansiyelini değerlendirmek için bir metilselüloz bazlı analiz tanımlamak gösterilmiştir.
Fonksiyonel dolaşım sistemi kan damarları ve kan hücrelerinin paralel geliştirilmesini gerektirmektedir. Kan geliştirme (ilkel hematopoez) erken aşamalarında, eritroblastta kökeni şiddetle 1 tartışılan kalır. Buna karşılık, kan hücresi gelişimi (kesin hematopoez) sonraki aşamalarında, multi-soy HSPC uzman vasküler endotelyal yolk kesesi, plasenta içindeki kan oluşturan potansiyel (hemogenic endotel hücreleri) elde hücreleri ve AGM ortaya çıktığını giderek daha açık hale gelmiştir 2-5, hem de vitellin ve göbek damar embriyonik endokard 6 ve baş damar 7. Bu farklı dokuların içinde hemogenic endotel hücrelerinin şartname Belirli gelişim aşamaları gerçekleşir; Örneğin, ~ E8.25 de yolk kesesi içinde ve ~ E10 8-12 de AGM içinde. hemogenic Endo Her şeye rağmen, bu özel gelişim pencereleri sırasında nüfus11,12 – (yolk kesesi ve AGM endotel hücrelerinin% 3 1), endotel hücreleri, endoteliyal hücreler, küçük bir bölümünü temsil eder. hemogenic endotel hücre "tarifnamede" bir işlem de, insan, hematopoiez olarak, murin için önemlidir. Hematopoietik hücreler sarısı kese damar endotel ve insan embriyolarından 13 aortundan tomurcuk gösterilmiştir ve çeşitli laboratuarları insan pluripotent kök hücreleri, kan hücresi üretimi 14-16 ara madde, bir endotelyal hücre gerekli olduğu da gösterilmiştir. Bu durumda, kemirgen hemogenic endotel hücrelerinin fenotipi tanımlanması ve insan pluripotent kök hücrelerden hemogenic endotel hücrelerinin üretimi için in vitro teknolojilerin takip kolaylaştırmalıdır bu hayvan modelinde bunların gelişmesine yol moleküler olayları anlama. Buna karşılık, çok nesilli HSPC gelen farklı kan hücre tiplerinin büyük ölçekli üretimi için bir yaklaşım nihai olarak geliştirilmesi – kendilerini Deriara fizyolojik ilgili hemogenic endotel hücre ile insan pluripotent kök hücrelerinden ved – hematolojik, onkolojik ve rejeneratif tıp için inanılmaz bir terapötik potansiyele sahip olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz embriyogenez sırasında kesin HSPC üretimin 11 ve AGM 12, iki büyük siteler kesesi fare sarısı içinde, bir klonal düzeyde, hemogenic endotel hücrelerinin fenotip tanımladınız. Bu nedenle Yetişkin kemik iliği 17, oluşum safhasındaki hemogenic endotel hücreleri ve HSPC sergi Hoechst boya akış özellikleri olan HSPC ve benzerleri "Yan nüfus" içinde (Şekil 3 'de gösterildiği gibi), bir FACS arsa 5,11,12 hücrelerinin (SP) görüntülenir. Buna ek olarak, aynı zamanda hemogenic endotel hücreleri hem endotelyal belirteçler ve hücreleri (sırasıyla flk1 ve cKit) kök ama hematopoietik kökenli işaretleyicisini CD45 5,11,12 ifade ettiklerini göstermiştir. Bu nedenle, hemogenic endotel hücreleri tanım olabilirified ve FACS ile izole flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri gibi, ve bu hücreler, yumurta sarısının ve AGM hücreleri 5,11,12 arasında Flk1- / cKit + / CD45 + SP fraksiyonu içinde ihtiva HSPC yol göstermiştir. Hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC, ya da (Şekil 1 'de gösterildiği gibi), ex vivo embriyo kültürü içinde 48 saat süre ile kültüre embriyolar olarak tanımlanır ve yolk kesesi ya da taze ötanazi embriyolar ya hasat AGM dokulardan izole edilebilir. Ex vivo kültür seçici izin farmakolojik maddeler tek tek embriyoların ön-işlem ve aynı zamanda arzu edilen transgenlerin (yani, lentiviral transdüksiyonu ile) kısa süreli bırakılması için izin verir. Bu tarifnamede tarif edilen yöntemle hemogenic endotel hücreleri ve HSPC FACS tespiti, genetik olarak manipüle fare modellerinde kesin hematopoietik gelişme nicel ölçüsü olarak kullanılabilir; hücreleri, kan-fo dahil olmak üzere sonraki deneysel uygulamalar için alınabilirrming deneyleri, ifade analizi ve nakli.
Hayvan Başlık: Kullanım ve Etik Hususlar
Literatürde artan vücut embriyonik gelişim kesin hematopoez aşamasında HSPC oluşumuna hemogenic endotel hücrelerinin önemli bir katkı kurmuştur. Bununla birlikte, bir hemogenic kaderi doğru endotelyal hücrelerin bir alt şartname teşvik fizyolojik koşullar ve sinyal yeterince anlaşılamamıştır, dolayısıyla henüz in vitro ortamda taklit edilemez. Nitekim, bu yazıda anlatılan tekniklerin ex vivo hemogenic endotel hücre özellikleri ve HSPC üretimi için bir yaklaşım, bir gün gelişmiş olabilir, öyle ki hematovascular gelişimi, alanın anlayışı geliştirmek için laboratuar ve diğer gruplar tarafından şu anda kullanımda. Bu zamana kadar, ancak alan primer vahşi tip doku (ve gen bağlıdır kalırola- rak değiştirilmiş) farenin embriyolar daha fazla çalışma için hemogenic endotel hücreleri ve HSPC belirtilen elde edildi. Hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC güvenilir bir şekilde tespit ve her iki E8.5 izole edilebilir (10-12 hücre gruplarının çifti) yumurta sarısının veya E10.5 (35-40 hücre gruplarının çift) 11,12 AGM. Nedeniyle hemogenic endotel hücrelerinin göreli kıtlığı (tipik olarak 1 temsil – Toplam endotel hücreleri bu dokuların içinde 11,12% 3) birden dokuların havuzu (~ 8 – 10) tek bir örnek haline yavrular kuvvetle amacıyla tavsiye edilir sonraki deney için yeterli hücre elde. hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC başarılı bir şekilde tanımlanmış ve izole edilmiş olduğunu doğrulaması hematopoietik değişimini etkileme koşullar altında alınan hücre kültürü ile elde edilebilir. Bu koşullar altında, hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC ery ihtiva kolonilerinin sonuçlanan çok soyundan hematopoyetik farklılaşmasını sergileyecekthroid progenitörler (BFU-E), granülosit ve makrofaj projenitörleri (CFU-GM), ve granülosit eritrosit, makrofaj, megakaryosit progenitör kolonileri (CFU-GEMM).
nedeniyle belirli gelişim pencereler boyunca sadece ortaya geçici ve küçük hücre popülasyonlarının okuyan doğasında teknik zorluklar henüz emekleme aşamasında olan bir alanda – hematovascular gelişme alanında pek çok yanıtsız soru vardır kalır. Yukarıda belirtilen tekniklerin hatta tek hemogenic endotel hücre hücreleri ve genellikle en laboratuarları mevcuttur reaktifler ve ekipman kullanılarak kritik gelişim zaman noktalarında embriyonik dokuda HSPC popülasyonlarının izole edilmesi için izin vererek bu zorlukların pek çok iyileştirme. Bizim protokol, daha sonraki analizlerde hemogenic endotel hücre fraksiyonu için kontroller, bağımsız analizler için kullanılabilir, ya da olabilir YS ve AGM olmayan hemogenic endotel hücre fraksiyonları, paralel izolasyonu sağlar.
Bu çok renkli FACS tabanlı yöntem kullanılarak hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu kilit nokta uygun spektral eşmpensation ve tek renkli kapılarının doğru çizimi. Bunun gibi, şiddetle lekesiz ve tek renkli kontrolleri, tüm deneysel çalışan dahil edilmesi tavsiye edilir, ve o – birlikte izotip-eşleştirilmiş kontrol antikorları ile tedavi örnekleri ile – başlangıçta uygun spektral tazminat ve kapıları çizimini kurmak için kullanılabilir. Ancak, spesifik olmayan boyama ve böylece lekesiz ve tek renkli kontrolleri FACS sıralayıcı ayarları optimize edildikten sonra kapıların rutin doğrulanması için yeterli Bu protokol ile düzeydedir.
Yanlış çizilmiş SP kapıları Bu raporda açıklanan yaklaşım ile özel bir endişe vardır. Daha önceki çalışmalar, multipotent kök hücreler FACS ile SP görünüşlerine fizyolojik temelini oluşturan, Hoechst Kırmızı 17 tercih edilen akışını sergilediklerini göstermiştir. Biz hemogenic endotel hücreleri göstermiştir ve HSPC benzer SP hücre fraksiyonu 5,11 içinde bulunur. kalsiyum kanal gibi ilaçlarönleyicisi Verapamil transmembran çoklu ilaç direnci taşıyıcılar çeşitli blokajı ile SP hücrelerinde bu Hoechst boya akış davranışını bloke eder. Hematopoietik kök ve projenitör hücrelerde, bu esas olarak ABCG2 / BCRP1 taşıyıcı 24 aracılığıyla gerçekleşir. Tipik haliyle verapamil SP>% 50 blokaj indükler, ancak görülen Verapamil ile Hoechst efflux genel derecesi ve daha sonraki blokajı bunun nedeni, muhtemelen ayırıcı Hoechst ile birden çok ilaca karşı dirençli taşıyıcı tipleri ekspresyonunu değiştirmek için, gelişim zamanlaması etkilenebilir gösterilmiştir Verapamil 5 akış yeteneği ve duyarlılık. Bu nedenle, güçlü Verapamil ile muamele önerilir Hoechst-lekeli negatif kontrol standart olarak uygun bir SP yolluk sağlamak için dahil edilebilir: Bir SP kapısı doğru çekildiğinde, SP hücrelerinin sayısında kayda değer bir azalma Hoechst ile boyanmış örneklerinde tespit edilmelidir Verapamil varlığı.
Biz daha önce göstermiştir sıralanmış olduğunuE9.5 fare yolk kesesi SP hücrelerinin ~ 80 var – E9.5 unfraksiyone eşleştirilmiş sayısıyla karşılaştırıldığında zaman metilselüloz bazlı hematopoetik kültüründe HSPC oluşturmak için 90 kat daha fazla yetenek, sigara Hoechst bütün YS doku hücrelerini 5 boyandı. SP ileri karakterizasyonu erken hematopoetik ve E8.0 damar gelişimi sırasında fare sarısı kesesinde göstermiştir ki, VE-kaderin ve Flk-1 kayda değer ifadesi, ama kök (c-Kit) ve hematopoetik belirteçlerin düşük ifadesi var (CD45). Böylece, + / CD45- olmayan SP hücreleri baskın Flk-1 + / CD31 olarak tanımlanan bu gelişimsel timepoint, ilkel (non-hemogenic) EC, at. Endotel markör ifade azaltır ve CD45 ve c-kit sentezleme arttıkça, E9.5 ve E11.5 5 ila in vitro HSPC oluşturmak için artan bir yeteneği ile birlikte bu ifade profili geçer. Bu YS doku hematopoetik aktivite E9.5 ve E11.5 ve occurr arasındaki en belirgin hale, SP içinde yer alıyor anlaşılacağıendotel özellikleri ve hematopoetik kapasitesi kademeli edinme zamanlanmış zarara ing. Bu nedenle, SP fenotip doğuran çok ilaca direnç taşıyıcıları ifadesi hemogenic endoteli 5 önemli fenotipik işaretleyici vardır; Aslında, AGM olmayan SP hücreleri, kan-oluşturan potansiyeli 12 göstermezler. Bu nedenle, YS ve AGM hem Hoechst boyama ile SP başarılı izolasyonu (hücre hemogenic ayrımcılık sağlayacak bu bölüm içinde, belirli bir doku, hematopoetik kök hücre bölmesine ve hücrelerin daha sonra antikor boyama ile ilgili kriteri olacağı Flk sağlar -1 + / c-Kit HSPC karşılık + / CD45-) (Flk1- / c-kit + / CD45 +) toplulukları 5,11,12. Ayrıca, daha önce yapılmış yolk kesesi ve AGM dokuların SP içinde CD41 + hücrelerinin metilselüloz bazlı kültürde 11,12 multi-soy koloni oluşumu yeteneğine sahip olduğunu not etmiştir. Bu flk1 + c-Kit + CD45- SP hücresi gibi hemogenic endotel hücrelerini tanımlayanhematopoetik soy belirlenmiş bir belirteci olarak CD45 kullanarak yerine CD41 bizim flk1 ve CD45 bu ifadeyi bularak verilen tarafından s 5,11 neredeyse birbirini dışlayan olduğunu. Bu, her iki endotelyal sahip SP içindeki hücrelerin saf izole edilmesine izin verir (flk-1) ve hematopoietik geçiş endotel için gerekli özelliklere (c-Kit) sapı bu CD45'in yokluğunda belirlendiği gibi olduğu henüz bu değişikliğe uğramamıştır hücreler. Son zamanlarda Gomez ve arkadaşları tarafından rapor gibi CSF1R + (doku makrofaj) ve Csf1r- (HSC) fraksiyon içine Flk-1 / c-Kit + / CD45 + / SP hücreleri olarak tanımlanan HSPC nüfusun alt ayırmasına, dikkate almak yararlı olacaktır 25, bu doku makrofaj progenitör popülasyonları karşı gerçek HSPC büyük çözünürlük sağlayacak, ama bu tecrit biz CSF1R beri belirttiğimiz makrofaj atalarıdır 26 bir belirtecidir hemogenic endotel hücre fraksiyonu bütünlüğünü etkilemez gerektiği gibi.
HemogENIC endotel hücreleri YS ve (1 içeren – endotel hücrelerinin,% 3), AGM hem de nadir bir alt popülasyonu, ve bu nedenle çalışma büyük bir sorun daha sonra uygulamalar için yeterli hücre verim elde edilmiştir. Bu protokol, genellikle% 10-20, hatta en uygun koşullar altında sadece birkaç yüz hücre verebilir sıralama zaman ve birden çok embriyo elde edilen toplanmış dokulardan tipik hemogenic endotel hücre sıralama tarafından canlı kalan hücreler% 70-80 sonuçlanır metilselüloz üreten koloniler içine gömülü hücreler alınır. dokular hızla disseke ve toplanmış olmalı ve numuneler mümkün olduğunda buz üzerinde tutulmalıdır: sıralı hücre sayısını arttırmak için, güçlü araştırmacılar prosedürün her adımda boyunca doku ve hücre canlılığı sağlamak için adımlar tavsiye edilir. Numuneler hemen önce FACS sıralama taze hazırlanmış ve tarif olarak metilselüloz kültürü doğrudan yüksek serum içeriği veya içeren toplama tüpleri içine sıralanması gerektiğiniYukarıda d. canlılık Sorun devam ederse, toplama tüpleri daha da sıralı hücre yaşamını geliştirmek için serum ile ön kaplanabilir. hemogenic endotel hücre verimi düşüktür takdirde yetişkin kemik iliği ya da ticari olarak temin edilebilen florofor eşlenik boncuklar, burada tarif edilen embriyonik doku türevli tek renk kontrol yerine spektral telafisi için kullanılabilmektedir. kriteri hücreler kültür için kullanılacaksa, hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC, doku kültürü oyuklarını doğrudan sıralanması. kriteri hücreler DNA ya da RNA-ilişkili gen ifade analizi, hemogenic olmayan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC yöneliktir Eğer hücre kaybı en aza indirmek için Örnek lizis tamponu ihtiva eden toplama tüpleri içine, doğrudan düzenlenmiş olabilir.
anlatılan teknik, aynı embriyonik dokular başarılı (ve aynı anda) hemogenic olmayan hemogenic endotel hücrelerinin elde edilmesi, hem de HSPC ve olgun kan hücre fraksiyonları izin verir. Bu yaklaşım, daha fazla damızlık sağlarendotel hücreleri kan üretmek olarak meydana kritik geçişleri moleküler temellerinin y. Bu gelişme çalışmalarından elde edilen fi- pluripotent insan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC döl üretimini optimize etmek için kullanılabilir ve potansiyel olarak otolog yaygın hematopoetik hastalıkların tedavisi için kök hücreleri olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |