Blodkreft stamceller og stamceller (HSPC) stammer fra spesialiserte (hemogenic) endotelceller under utvikling, men lite er kjent om prosessen der noen endotelceller spesifisere å bli bloddannende. Vi viser en flow-cytometri basert fremgangsmåte som tillater samtidig isolering av hemogenic endotelceller og HSPC fra muse-embryonale vev.
Spesifikasjonen av hemogenic endotelceller fra embryonale vaskulærendotelet oppstår under korte utviklingsperioder innenfor forskjellige vev, og er nødvendig for fremveksten av definitive HSPC fra murine ekstra embryonale plommesekken, morkaken, navle fartøy, og de embryonale aorta-gonade-mesonephros ( AGM) region. Forbigående art og liten størrelse av denne cellepopulasjon treffer sin reproduserbar isolasjon for forsiktig kvantifisering og eksperimentelle applikasjoner teknisk vanskelig. Vi har etablert en fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) -basert protokoll for samtidig isolering av hemogenic endotelceller og HSPC under deres peak generasjonstid i plommesekken og AGM. Vi viser metoder for disseksjon av plommesekken og AGM vev fra mus embryoer, og vi presenterer optimalisert vev fordøyelsen og antistoffkonjugering forhold for maksimal celle overlevelse før identifisering og gjenfinning via FACS. Representant FACS analysis tomter er vist at identifisere hemogenic endotelceller og HSPC fenotyper, og beskriver en metylcellulose-baserte analysen for å vurdere deres blod forming potensial på en klonal nivå.
En funksjonell sirkulasjonssystemet krever en parallell utvikling av blodkar og blodceller. På de tidligste stadiene av blod utvikling (primitive hematopoiesis), forblir opprinnelsen erytroblaster kraftig debattert en. I motsetning til ved senere stadier av blodcellenes utvikling (definitive hematopoiesis), har det blitt stadig klarere at multi-avstamning HSPC oppstå fra spesialiserte vaskulære endotelceller som kjøper bloddannende potensielle (hemogenic endotelceller) i plommesekken, morkaken og AGM 2-5, samt i vitelline og umbilicals fartøy, embryonale endocardium 6, og hodet blodkar 7. Spesifikasjonen av hemogenic endotelceller innenfor disse forskjellige vev oppstår på bestemte stadier av utvikling; for eksempel innenfor plommesekken på ~ E8.25 og innen generalforsamlingen på ~ E10 8-12. Likevel, selv under disse spesifikke utviklings vinduer, befolkningen i hemogenic endothelial celler representerer en liten fraksjon av alle endotelceller (1 – 3% av plommesekken og AGM endotelceller) 11,12. Prosessen med hemogenic endotelial celle "beskrivelse" er kritisk for murin, så vel som human, hematopoiesis. Hematopoetiske celler har vist seg å knopp fra endotelet i plommesekken fartøyer og aorta i menneskelige embryo 13, og flere laboratorier har vist at blodceller fra humane pluripotente stamceller kreves en endotelcelle mellomliggende 14-16. Dermed definerer fenotype av murine hemogenic endotelceller og forstå de molekylære hendelser som fører til deres utvikling i denne dyremodell skal lette arbeidet for in vitro teknologier for generering av hemogenic endotelceller fra menneskelige pluripotente stamceller. I sin tur, eventuell utvikling av en metode for storskala produksjon av differensierte blodcelletyper fra multilineær HSPC – selv deriVed fra menneskelige pluripotente stamceller via en fysiologisk relevant hemogenic endotelceller mellom – ville ha utrolig terapeutisk potensial for hematologisk, onkologisk og regenerativ medisin. Mot dette målet, har vi definert fenotype av hemogenic endotelceller, på en klonal nivå, innen murine plommesekken 11 og AGM 12, to store områder av definitive HSPC produksjon i løpet embryogenese. Som HSPC innenfor voksen benmarg 17, embryonale hemogenic endotelceller og HSPC oppviser Hoechst fargestoff efflux egenskaper, og derfor vises i den "side populasjonen» (SP) av celler på en FACS plott 5,11,12 (som vist i figur 3). I tillegg har vi også vist at hemogenic endotelceller uttrykke markører av både endotel- og stamceller (Flk1 og cKit, henholdsvis), men uttrykker ikke hematopoetiske linjen markøren CD45 5,11,12. Således kan hemogenic endotelceller være identsert og isolert ved FACS som Flk1 + / cKit + / CD45- SP-celler, og vi har vist at disse cellene gir opphav til HSPC inneholdt i Flk1- / cKit + / CD45 + SP brøkdel av plommesekken og AGM-celler 5,11,12. Hemogenic endotelceller og HSPC kan identifiseres og isoleres fra plommesekken eller AGM vev høstet fra enten fersk avlives embryoer, eller fra embryoer dyrket i opptil 48 timer i ex vivo embryo kultur (som vist i figur 1). Ex vivo kultur tillater selektiv forbehandling av individuelle embryoer med farmakologiske midler, og også gir mulighet for forbigående uttrykk for ønskede transgener (dvs. ved lentiviral transduksjon). FACS identifikasjon av hemogenic endotelceller og HSPC ved fremgangsmåten beskrevet heri kan anvendes som et kvantitativt mål på definitiv hematopoetiske utvikling i genetisk manipulerte musemodeller; cellene kan også hentes for påfølgende eksperimentelle programmer, inkludert blod-forming analyser, uttrykk analyse, og transplantasjon.
Animal Emner: Bruk og etiske hensyn
En voksende mengde litteratur har etablert viktige bidrag hemogenic endotelceller til HSPC formasjon under den definitive hematopoiesis stadium av embryonal utvikling. Likevel forblir de fysiologiske tilstander og signaler som fremmer spesifisering av en subpopulasjon av endotelceller mot en hemogenic skjebne dårlig forstått, og kan derfor ikke ennå bli etterlignet i en in vitro omgivelser. Faktisk teknikkene beskrevet i denne artikkelen er for øyeblikket i bruk av vår lab og andre grupper for å forbedre feltets forståelse av hematovascular utvikling, slik at en tilnærming for ex vivo hemogenic endotelceller spesifikasjon og HSPC produksjon kan en dag bli utviklet. Inntil imidlertid fortsatt feltet avhengig av primære vev fra villtype (og gentisk modifisert) museembryoer å skaffe spesifisert hemogenic endotelceller og HSPC for videre studier. Hemogenic endotelceller og HSPC kan bli pålitelig identifisert og isolert fra enten E8.5 (10 – 12 somitt par) plommesekken eller E10.5 (35 – 40 somitt par) AGM 11,12. På grunn av den relative mangelen på hemogenic endotelceller (vanligvis representerer 1-3% av totalt antall endotelceller 11,12 innenfor disse vev) kontinuitets vev fra flere (~ 8 – 10) kullsøsken i en enkelt prøve er sterkt anbefalt for å skaffe tilstrekkelig celler for senere eksperimentering. Verifisering av at hemogenic endotelceller og HSPC har blitt identifisert og isolert kan oppnås ved dyrkning av hentede celler under betingelser som induserer differensiering blodkreft. Under disse betingelser vil hemogenic endotelceller og HSPC oppviser multilineær hematopoetiske differensiering, noe som resulterer i fremkomsten av kolonier som inneholder erithroid stamfedre (BFU-E), granulocytter og makrostamfedre (CFU-GM), og granulocytter, erytrocytter, makrofag, megakaryocytt progenitor kolonier (CFU-GEMM).
Det gjenstår mange ubesvarte spørsmål innen hematovascular utvikling – et felt som er fortsatt i sin barndom på grunn av tekniske problemer ligger i å studere forbigående og små cellepopulasjoner som bare dukker opp i løpet av spesifikke utviklings vinduer. Teknikkene som er beskrevet ovenfor lindre mange av disse vanskelighetene ved å tillate isolering av til og med enkeltceller fra hemogenic endotelcelle og HSPC populasjoner i embryonale vev ved kritiske utviklingsmessige tidspunkter ved bruk av reagenser og utstyr som vanligvis er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Vår protokollen tillater også for parallell isolering av ikke-hemogenic endotelcelle fraksjoner fra YS og AGM, som kan brukes for uavhengig analyse, eller som kontroller for den hemogenic endotelial cellefraksjon i etterfølgende analyser.
Et sentralt punkt i isolering av hemogenic endotelceller ved hjelp av denne flerfarget FACS-basert metode er hensiktsmessig spektral compensation og nøyaktig tegning av ensfargede porter. Som sådan, er det sterkt anbefalt at unstained og ensfargede kontroller skal inkluderes i alle eksperimentkjøringer, og at de – sammen med prøvene som er behandlet med isotype-matchet kontroll antistoff – brukes til å begynne med å etablere riktig spektral kompensasjon og tegning av porter. Imidlertid er ikke-spesifikk farging minimal ved denne protokollen, og dermed ufargede og ensfargede kontrollene er tilstrekkelig for rutinemessig kontroll av portene gang FACS sorter innstillingene har blitt optimalisert.
Feilaktig trukket SP portene er en spesiell bekymring med tilnærmingen som er beskrevet i denne rapporten. Tidligere studier har vist at multipotente stamceller oppviser preferensiell effluks av Hoechst rødt 17, som danner den fysiologiske basis for deres opptreden i SP ved FACS. Vi har vist at hemogenic endotelceller og HSPC er på lignende måte funnet i SP cellefraksjon 5,11. Stoffer som for eksempel kalsiumkanal ihibitor Verapamil blokkere denne Hoechst fargestoff utstrømming atferd i SP celler via blokkering av en rekke transmultiresistens transportører. I blodkreft stamceller og stamceller, dette skjer primært via ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Vanligvis verapamil induserer> 50% blokkering av SP, men den samlede graden av Hoechst effluks og dens påfølgende blokkering av Verapamil sett har vist seg å bli påvirket av utviklings timing, antagelig på grunn av skiftende ekspresjon av multiple multilegemiddelresistente transportørtyper med differensial Hoechst efflux evne, og følsomhet for Verapamil 5. Således er det sterkt anbefalt at Verapamil-behandlede Hoechst-farget negativ kontroll være standardmessig inkludert for å sikre korrekt SP gating: hvis et SP-port er riktig tiltrukket, bør en bemerkelsesverdig reduksjon i antallet SP-celler påvises i prøver farget med Hoechst i tilstedeværelsen av Verapamil.
Vi har tidligere vist at sorteresSP celler fra E9.5 murine plommesekken har en ~ 80-90 ganger større evne til å generere HSPC i metylcellulose baserte blodkreft kultur sammenlignet med en matchet antall E9.5 ufraksjonert, ikke-Hoechst farget hele YS vev celler 5. Ytterligere karakterisering av SP har vist at i den murine plommesekken i løpet av tidlig hematopoietisk og vaskulær utvikling i E8.0, er det vesentlig ekspresjon av VE-cadherin og Flk-1, men lav ekspresjon av spindelen (c-Kit) og hematopoetiske markører (CD45). Dermed på dette utviklingsendepunktet, opprinnelige (ikke-hemogenic) EC, definert som Flk-1 + / CD31 + / CD45- non SP celler dominerer. Dette uttrykket profil turnus som endothelial markør uttrykk minker og CD45 og c-Kit uttrykk øker, samtidig med en økende evne til å generere HSPC in vitro mellom E9.5 og E11.5 5. Dette tyder på hematopoietisk aktivitet av YS vev befinner seg inne i SP, blir mest åpenbare mellom E9.5 og E11.5, og har funnet sted,ing gjennom en tidsbestemt tap av endotelceller egenskaper og gradvis oppkjøp av blodkreft kapasitet. Som sådan, ekspresjon av multiresistens transportører som gir opphav til SP-fenotypen er en viktig fenotypisk markør av hemogenic endotel 5; faktisk, trenger ikke-SP celler fra generalforsamlingen ikke viser bloddannende potensial 12. Således sikrer vellykket isolering av SP via Hoechst flekker både i YS og AGM at cellene vil bli sortert fra det hematopoetiske stamcellelinjen av en gitt vev, og påfølgende antistoff farging av celler i denne fraksjon vil tillate diskriminering av den hemogenic (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populasjoner 5,11,12. Videre har det tidligere blitt bemerket at CD41 + celler i SP av plommesekken og AGM vevet er i stand til multilineær kolonidannelse i metylcellulose basert kultur 11,12. Vi definerer hemogenic endotelceller som Flk1 + c-Kit + CD45- SP celles ved hjelp av CD45 som en utpekt markør for blodkreft avstamning snarere enn CD41 gitt våre opplever at uttrykk for Flk1 og CD45 er nesten gjensidig utelukkende 5,11. Dette tillater en ren isolering av celler i SP som har både endotelial (Flk-1) og stammen egenskaper (c-Kit) som er nødvendige for endotelial til hematopoetiske overgang, men som ennå ikke har gjennomgått denne forandring, som bestemt ved fravær av CD45 i disse celler. Det ville være nyttig å vurdere underfraksjonering av HSPC befolkning, definert som Flk-1 / c-kit + / CD45 + / SP-celler, inn Csf1r + (vev makrofag) og Csf1r- (HSC) fraksjonen som nylig rapportert av Gomez og kolleger 25, da dette ville gi større oppløsning av det sanne HSPC versus vev makrofag progenitorceller populasjoner, men dette bør ikke påvirke integriteten av hemogenic endotelial cellefraksjon hvis isolasjon vi har skissert siden Csf1r er en markør for makrofag progenitorceller 26.
HemogENIC- endotelceller er en sjelden undergruppe i både YS og AGM (bestående av 1-3% av endotelceller), og derfor en stor utfordring i sin studie er utilstrekkelig celle yield for senere søknader. Denne protokollen vanligvis resulterer i 70-80% av cellene gjenværende levedyktige ved tidspunktet for sortering, og en typisk hemogenic endotelcelle slag fra sammenslåtte vev oppnådd fra flere embryoer kan gi bare noen få hundre celler, selv under optimale betingelser med bare 10-20% av hentes celler innebygd i metylcellulose produsere kolonier. For å maksimere sortert celle nummer, er det sterkt anbefalt at etterforskerne ta skritt for å sikre vev og celle levedyktighet gjennom hvert trinn i prosedyren: vev bør raskt dissekert og samlet, og prøvene bør holdes på is når det er mulig. Prøvene bør fremstilles friskt umiddelbart før FACS sortering, og sortert i prøverør inneholdende høye seruminnhold, eller direkte inn i methylcellulose kultur som beskrived ovenfor. Hvis levedyktighet problemene vedvarer, samling rør kan også være pre-belagt med serum til å ytterligere styrke sortert celle overlevelse. Hvis hemogenic endotelcelle utbytte forblir lavt, kan voksen benmarg eller kommersielt tilgjengelige fluoroforen-konjugerte perler anvendes for spektral kompensering i stedet for den embryonale vev-avledede enkelt farge kontrollene som er beskrevet heri. Hvis sorterte cellene er ment for kultur, bør hemogenic endotelceller og HSPC skal sorteres direkte inn i vevskultur brønner. Hvis sorterte cellene er beregnet for DNA eller RNA relatert genekspresjon analyse, hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller og HSPC kan sorteres direkte inn i oppsamlings rør som inneholdt prøvelyseringsbuffer for å redusere celletap.
Den skisserte teknikk tillater vellykket (og samtidig) isolering av hemogenic og ikke-hemogenic endotelceller, samt HSPC og modne blodcellefraksjoner fra de samme embryonale vev. Denne tilnærmingen gjør videre study av de molekylære fundamentet for de kritiske overganger som oppstår som endotelceller generere blod. Innsiktene fra denne utviklingsstudier kan deretter brukes til å optimalisere produksjonen av humane hemogenic endotelceller og HSPC avkom fra pluripotente, og potensielt autologe, stamceller for behandling av utbredte hematopoietiske forstyrrelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |