La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Las mucinas, las proteínas fuertemente glicosiladas que recubren las superficies mucosas, se han desarrollado como un componente clave en la defensa innata mediante la protección del epitelio contra los patógenos invasores. La función principal de estas macromoléculas es el de facilitar la captura de partículas y la limpieza, mientras que la promoción de la lubricación de la mucosa. Durante la síntesis de proteínas, las mucinas se someten intensa O-glicosilación y la multimerización, que aumentan dramáticamente la masa y el tamaño de estas moléculas. Estas modificaciones post-traduccionales son esenciales para las propiedades viscoelásticas de moco. Como resultado de la naturaleza compleja bioquímicas y biofísicas de estas moléculas, trabajando con mucinas ofrece muchos retos que no se pueden superar por métodos de análisis de proteínas convencionales. Por ejemplo, su alto peso molecular impide la migración electroforética a través de geles de poliacrilamida regulares y su naturaleza pegajosa provoca la adhesión a un tubo experimental. Sin embargo, la investigación del papel de las mucinas en la salud(Por ejemplo., El mantenimiento de la integridad de la mucosa) y la enfermedad (por ejemplo., Hiperconcentración, mucoestasis, cáncer) ha ganado recientemente el interés y las mucinas se están investigando como una diana terapéutica. Una mejor comprensión de la producción y función de macromoléculas de mucina puede conducir a enfoques farmacéuticos nuevos, por ejemplo, inhibidores de mucina exocitosis de gránulos y / o agentes mucolíticos. Por lo tanto, los protocolos coherentes y fiables para investigar la biología de mucina son fundamentales para el progreso científico. Aquí, se describen los métodos convencionales para separar macromoléculas de mucina por electroforesis utilizando un gel de agarosa, la transferencia de la proteína en la membrana de nitrocelulosa, y detectar la señal con anticuerpos de mucina específica, así como lector de gel fluorescente en el infrarrojo. Estas técnicas son ampliamente aplicables para determinar mucina cuantificación, la multimerización y para poner a prueba los efectos de compuestos farmacológicos sobre mucinas.
Introduction
Las mucinas se producen normalmente por las superficies de la mucosa que recubren las cavidades expuestas al ambiente externo (por ejemplo., Respiratorio, tracto digestivo, reproductivos, superficie ocular), así como los órganos internos (por ejemplo, páncreas, vesícula biliar, glándulas mamarias). La presencia de estas glicoproteínas mantiene la hidratación de la superficie y forma una barrera física contra los patógenos. Aunque la producción de mucina es esencial para la mucosa de la salud, hiperconcentración de mucina y / o propiedades del moco aberrantes puede conducir a la obstrucción de los conductos, la colonización bacteriana y la inflamación crónica, que puede causar daño irreversible del tejido. Una cascada de acontecimientos similares se observan en varias enfermedades, por ejemplo., Fibrosis quística 1, 2 otitis media crónica y la infección cervicovaginal 3. Por lo tanto, es importante entender el papel de las mucinas en la salud y la enfermedad y establecer protocolos de rutina para la identificación de proteínas.
Hasta la fecha, Se han identificado 19 genes mucinas y codifican cadenas de polipéptidos grandes que van desde 1200 (por ejemplo., MUC1) a 22.000 (por ejemplo, MUC16) aminoácidos. La familia de genes de mucina se puede dividir en dos subtipos: las mucinas asociadas a la membrana, que participan en la señalización celular y la superficie de blindaje, y las mucinas formadoras de gel, responsable de las propiedades viscoelásticas de los geles de moco. mucinas asociadas a la membrana son en su mayoría monomérica y se adhieren a las superficies de las células a través de un dominio que atraviesa la membrana hidrófoba. Por el contrario, las mucinas formadoras de gel poseen varios -como y dominios ricos en cisteína factor de von Willebrand (vWF) que son esenciales para la formación de redes poliméricas dinámicos. Grandes glicanos están unidos a residuos de serina y treonina distribuidos por todo el apomucina. Estos oligosacáridos O-ligados densos pueden contribuir hasta 80% del peso molecular 4. enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares que conectan monómeros de mucina asegurar la integridad de la Networ gel de mucinak. Como resultado de la glicosilación pesada y multimerización, mucinas están entre las moléculas más grandes en el mundo animal y no pueden ser analizados por electroforesis en gel estándar utilizando gel de poliacrilamida SDS-PAGE convencional y escaleras de proteínas estándar. Estos métodos se resuelven / proteínas separadas con pesos moleculares inferiores a 250 kDa, mientras que los monómeros de mucina pueden alcanzar hasta 2 MDa en el caso de MUC16. Sin embargo, las escaleras de proteínas de alto peso molecular se pueden utilizar para estudiar pequeñas monómeros de mucina (es decir., MUC1).
Una variedad de técnicas se pueden aplicar para estudiar el tamaño de mucina, la conformación y la interacción. Tradicionalmente, la caracterización bioquímica de las mucinas se logra mediante la mucina aislamiento mediante centrifugación isopícnica en gradiente de densidad en un tampón de desnaturalización, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño y la inmunodetección (por ejemplo., Transferencia slot) 5. y / o dispersión de luz multiángulo dinámico proporciona información sobre el estado oligomérico de muestras de mucina ricos <sup> 1. Además, la centrifugación de la velocidad zonal junto con la inmunodetección y microscopía electrónica de transmisión se utiliza comúnmente para determinar la conformación macromolecular de mucinas 6. La espectrometría de masas también se utiliza para cuantificar las mucinas, detectar la escisión proteolítica y analizar oligosacárido composición 1,7,8. Tales técnicas son costosas, consume tiempo y a menudo requieren grandes volúmenes y / o altas concentraciones de muestra. La metodología descrita en el presente documento, es decir., Mucina separación por electroforesis, es reproducible, de bajo coste y se puede utilizar en estudios de alto rendimiento para proporcionar la cuantificación relativa y mucina investigar montaje polímero. Sin embargo, este ensayo requiere de alta afinidad y de alta especificidad de mucina anticuerpos que pueden no estar disponibles para mucinas raras (por ejemplo., MUC19) o ciertas especies (por ejemplo., Cerdo, hurón).
Western Blot La agarosa es adecuado para resolver una amplia variedad de muestras de mucina ricos con concentraciónlas que van desde 50 mg / ml (por ejemplo., lavados de células) a 5 mg / ml (por ejemplo., esputo). Este ensayo fue introducido en la década de 1990 y sólo se realizó en pocos laboratorios especializados 9,10. Inicialmente, esta técnica ayudó a identificar subpoblaciones de monómeros de mucina en las secreciones respiratorias humanas 11,12 y confirmó el proceso de oligomerización en las células caliciformes, que consiste en la formación de dímeros en el retículo endoplasmático, seguido de multimerización dímero en el aparato de Golgi 13. Más recientemente, la generación de anticuerpos policlonales contra mucinas murinos facilitó los estudios en modelos animales pequeños (por ejemplo., Mucina, modelos de ratones desafiados con OVA βENaC, deficientes) y abrió un nuevo campo de investigación para los estudios preclínicos probar compuestos farmacológicos destinados a eliminar la mucosidad de los pulmones 14-17. Como resultado de un creciente interés en la biología de mucina y la generación de nuevo, los anticuerpos de mucina más específicos, que describen traducción de estasn la metodología para separar las mucinas por electroforesis en gel de agarosa, transferencia de vacío a nitrocelulosa y la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de transferencia de Western de mucina se describe en este vídeo combina técnicas convencionales utilizados en biología molecular para separar y transferir grandes macromoléculas, tales como ADN, con las técnicas habituales para la detección de proteínas, es decir., Inmunotransferencia. La misma técnica se podría aplicar para estudiar la biología de los glicosaminoglicanos complejos, tales como la descomposición de ácido hialurónico de alto peso molecular 18. Aunque esta téc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
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