Eiwitsynthese Bioconjugaten<em> via</em> Cysteïne-maleïmide Chemistry
Summary
Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugatie omvat het covalent koppelen van een biomolecuul met elkaar of met een synthetisch molecuul zoals een kleurstof, geneesmiddel of een polymeer. Eiwit bioconjugatie methoden worden nu op grote schaal gebruikt in tal van chemie, biologie en nanotechnologie onderzoeksgroepen met toepassingen, variërend van fluorescerende kleurstof etikettering 1,2, het maken van eiwit (antilichaam) -prodrugs 3 (antilichaam geneesmiddel conjugaten – ADC) synthese van eiwitten dimeren 4,5 , tot en met zelfassemblerende eiwit-polymeer hybriden 6,7 gebruikt in nanomedicine 8 en systemen chemie 9.
Specificiteit van de chemie voor bioconjugatie, hoewel niet altijd kritisch is van groot belang voor de meeste functioneel eiwit bioconjugaten, zodat het niet interfereert met de actieve plaats van het doeleiwit. De ideale bioconjugatie reactie moet verschillende criteria, waaronder: i) gericht zeldzame of unieke plaatsen op het eiwit van interesse,ii) selectief in de richting van deze doelstelling, iii) gaat u onder niet-denaturerende omstandigheden om eiwitten te voorkomen ontvouwen en iv) zijn hoge opbrengst als het doelwit eiwit is meestal alleen verkrijgbaar bij sub-millimolair concentratie. De maleimide – cysteine Michael-additie benadert voldoen aan al deze criteria, en is daarom lang een bijzondere status op het gebied van bioconjugaatchemie 10 geclaimd. Dit komt omdat i) verschillende proteïnen die slechts één cysteïneresidu op hun oppervlak genetisch daar kunnen worden gemanipuleerd, ii) en het juiste pH de reactie zeer selectief is ten aanzien cysteïne, iii) geleidelijk plaats in waterige buffers en iv) het is zeer snel de tweede orde snelheidsconstante van maleïmiden naar cysteine bevattende eiwitten gerapporteerd 5000 M -1 sec -1 overschrijdt in sommige gevallen 11. Mits het eiwit van belang kan een klein (≈ 5-10%) hoeveelheid organische tolereren hulpoplosmiddel 12, bijna elke maleïmide gefunctionaliseerde kleurstof, poLymer, oppervlak of een ander eiwit te koppelen aan proteïnen. Bovendien, maleïmiden zijn specifiek voor cysteïnen op eiwitten dan iodoacetamides, die meer vatbaar voor reactie met andere nucleofielen bij verhoogde pH zijn; en stabieler dan disulfide-gebaseerde vervoegingen die moeten bij zure pH worden gehouden disulfide uitwisseling 13 te voorkomen.
Hier beschrijven we een algemeen protocol voor de conjugatie van maleïmide gefunctionaliseerde moleculen een eiwit dat een cysteïnerest via de reactie tussen een Ru (II) gebaseerde chromofoor en redoxeiwit cytochroom c als voorbeeld. Dit protocol geldt evenzeer voor de meeste andere eiwitten die een toegankelijk oppervlak cysteïnerest en de overeenkomstige maleïmide gefunctionaliseerde doel, hetzij een ander eiwit, een fluorescerende kleurstof, een chromofoor of een synthetisch polymeer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zuivering van de uitgangsmaterialen voor een bioconjugatie van het allergrootste belang. Proteïnen verkregen uit commerciële recombinante bronnen bevatten vaak andere isovormen van het eiwit van belang, die verschillende oppervlaktechemie en reactiviteit hebben. Bijvoorbeeld in de beschreven bioconjugatie, in de handel verkrijgbare cyt c bevat een mengsel van beide iso-1 en iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 en iso-1 vormen van cytochroom c grotendeels homoloog, met als belangrijkste ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
