Synthèse des bioconjugués protéiques<em> via</em> Cystéine-maléimide Chemistry
Summary
Ce protocole détaille les étapes importantes nécessaires pour la bioconjugaison d'une cystéine contenant la protéine à un maléimide, y compris la purification des réactifs, des conditions de réaction, la purification de bioconjugués et bioconjugué de caractérisation.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugaison consiste à lier de façon covalente une molécule biologique avec un autre ou avec une molécule synthétique tel qu'un colorant, un médicament ou un polymère. Méthodes de bioconjugaison de protéines sont maintenant largement utilisés dans de nombreux groupes de recherche chimie, la biologie et de la nanotechnologie avec des applications allant de fluorescent étiquetage de colorant 1,2, ce qui rend la protéine (anticorps) -prodrugs 3 (conjugués anticorps – médicaments – CAN) la synthèse de dimères de protéines 4,5 grâce à des hybrides d'auto-assemblage des protéines utilisées dans les polymères 6,7 nanomedicine 8 et les systèmes de chimie 9.
Spécificité de la chimie utilisée pour la bioconjugaison, tandis que pas toujours critique, est d'une importance capitale pour les bioconjugués protéiques les plus fonctionnels, de manière à ne pas interférer avec le site actif de la protéine cible. La réaction de bioconjugaison idéal doit remplir plusieurs critères, y compris: i) ciblant des sites rares ou uniques sur la protéine d'intérêt,ii) être sélectif vers cet objectif, iii) procéder dans des conditions non dénaturantes pour éviter le dépliement des protéines et iv) être à haut rendement comme la protéine cible est habituellement disponible uniquement à la concentration de sous-millimolaire. Le maléimide – Michael addition de cystéine se rapproche de remplir tous ces critères, et a pour cette raison selon longtemps un statut particulier dans le domaine de la chimie bioconjugué 10. En effet, i) de nombreuses protéines contenant des résidus une seule cystéine sur leur surface peuvent être génétiquement là, ii) au bon pH de la réaction est très sélective vers cystéine, iii) il se déroule sans problème dans des tampons aqueux et iv) il est très rapide avec la seconde constante de vitesse de premier ordre de maléimides à des protéines contenant de la cystéine déclarés dépasse 5 000 M -1 s -1 dans certains 11 cas. Pourvu que la protéine d'intérêt peut tolérer un petit (≈ 5-10%) quantité de co-solvant organique 12, presque tout colorant maléimide fonctionnalisés, poLymer, une surface ou une autre protéine peut être liée aux protéines. En outre, les maléimides sont plus spécifiques pour les cysteines sur les protéines que les iodoacétamides, qui sont plus enclins à réagir avec d'autres agents nucléophiles à un pH élevé; et plus stables que les conjugaisons à base de disulfures, qui doivent être conservés à un pH acide pour empêcher l' échange de disulfure 13.
Nous rapportons ici un protocole générique pour la conjugaison de molécules à fonction maléimide à une protéine contenant un résidu de cystéine unique en utilisant la réaction entre un Ru (II) à base chromophore et la protéine d'oxydo – réduction du cytochrome c à titre d'exemple. Ce protocole est également applicable à la plupart des autres protéines contenant un résidu de cystéine de la surface accessible et la cible correspondante à fonction maléimide, que ce soit une autre protéine, un colorant fluorescent, un chromophore ou un polymère synthétique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purification des matières premières avant une bioconjugaison est d'une importance capitale. Les protéines obtenues à partir de sources recombinantes du commerce contiennent souvent d'autres isoformes de la protéine d'intérêt, qui peut avoir différentes chimie de surface et de la réactivité. Par exemple, dans la bioconjugaison décrit, la cyt disponible dans le commerce c contient un mélange des deux iso-1 et iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 et l' iso-1 forme de cytochro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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