סינתזה של חלבון Bioconjugates<em> דרך</em> כימיה ציסטאין-maleimide
Summary
פרוטוקול זה מפרט את הצעדים החשובים הנדרשים bioconjugation של ציסטאין המכיל חלבון על maleimide, כוללים טיהור מגיבה, תנאי תגובה, טיהור bioconjugate ואפיון bioconjugate.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugation עוסק בחיבור קוולנטית biomolecule אחד עם השני או עם מולקולה סינתטית כגון צבע, סמים או פולימר. שיטות bioconjugation חלבון נמצאות כיום בשימוש נרחב קבוצות מחקר כימיה, ביולוגיה וננוטכנולוגיה רבות עם יישומים החל תיוג פלורסנט לצבוע 1,2, מה שהופך של חלבון (נוגדן) -prodrugs 3 (conjugates תרופת נוגדן – ADC) סינתזה של הדימרים חלבון 4,5 , ועד כלאי חלבון-פולימר הרכבה עצמית 6,7 המשמשים כימיה nanomedicine 8 ומערכות 9.
ספציפית של הכימיה המשמש bioconjugation, בעוד לא תמיד קריטי, הוא בעל חשיבות עליונה עבור bioconjugates חלבון הפונקציונלי ביותר, כדי לא להפריע את האתר הפעיל של חלבון המטרה. תגובת bioconjugation האידיאלית צריכה לקיים מספר קריטריונים, כולל: i) מיקוד אתרים נדירים או ייחודיים על החלבון של עניין,ii) להיות סלקטיבית כלפי יעד זה, iii) להמשיך בתנאים שאינם denaturing להימנע חלבון התגלגלות iv) להיות גבוה מניב כמו חלבון המטרה הוא בדרך כלל זמין רק בריכוז תת-millimolar. Maleimide – ציסטאין מיכאל בנוסף מתקרב להגשמת כל הקריטריונים הללו, ויש לו מסיבה זו טענה ארוכה מעמד מיוחד בתחום כימית bioconjugate 10. הסיבה לכך היא כי אני) חלבונים רבים המכילים שאריות ציסטאין היחיד על פני השטח שלהם יכול להיות מהונדסים גנטית שם, ב) על pH הנכון התגובה היא מאוד סלקטיבית כלפי ציסטאין, iii) זה יתנהל למישרין מאגרים מימיים iv) זה מהר מאוד עם קבוע של maleimides שיעור מסדר שני חלבונים המכילים ציסטאין דיווחו יעלה 5,000 M -1 שניות -1 ובמקרים מסוימים 11. ספקו את החלבון של עניין יכול לסבול קטנה (≈ 5-10%) כמות אורגן שיתוף ממסים 12, כמעט כל צבען פונקציונלי maleimide, פוlymer ומשטחים או חלבון אחר יכול להיות קשור חלבונים. בנוסף, maleimides הם ספציפי יותר עבור cysteines על חלבונים מאשר iodoacetamides, אשר נוטה יותר להגיב עם נוקלאופיל אחר ב- pH הגבוהה; ויציבה יותר מאשר גזרה בבניינים מבוססי דיסולפיד אשר צריך להישמר ב- pH חומצי כדי למנוע חילופי דיסולפיד 13.
כאן אנו מדווחים פרוטוקול גנרי הנטייה של מולקולות פונקציונלי maleimide לחלבון המכיל שאריות ציסטאין יחידות באמצעות התגובה בין Ru (II) כרומופור מבוסס ואת ציטוכרום C חלבון חיזור כדוגמא. פרוטוקול זה הוא החלים באופן שווה על רוב החלבונים אחרים המכילים שאריות ציסטאין משטח נגישות ויעד maleimide הפונקציונלית המקביל, בין אם הוא חלבון אחר, צבע ניאון, כרומופור או פולימר סינטטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיהור של חומרים החל לפני bioconjugation הוא בעל חשיבות עליונה. חלבונים שהושגו ממקורות מסחריים רקומביננטי בדרך כלל מכילים isoforms אחר של החלבון של עניין, אשר יכולה להיות כימית תגובתיות משטח שונה. לדוגמא, ב bioconjugation המתואר, ג CYT הזמין המסחרי מכיל תערובת של שניהם 12,14,17 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
