प्रोटीन Bioconjugates के संश्लेषण<em> के माध्यम से</em> सिस्टीन maleimide कैमिस्ट्री
Summary
इस प्रोटोकॉल का विवरण एक सिस्टीन एक maleimide के लिए प्रोटीन युक्त, अभिकर्मक शुद्धि, प्रतिक्रिया की स्थिति, bioconjugate शुद्धि और bioconjugate लक्षण वर्णन शामिल करने की bioconjugation के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम।
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugation covalently इस तरह के एक डाई, दवा या एक बहुलक के रूप में एक साथ या एक सिंथेटिक अणु के साथ एक बायोमोलिक्यूल लिंक करना पड़ता है। प्रोटीन bioconjugation तरीकों अब बड़े पैमाने पर फ्लोरोसेंट रंजक लेबलिंग 1,2 से लेकर आवेदन के साथ कई रसायन विज्ञान, जीव विज्ञान और नैनो अनुसंधान समूहों में किया जाता है, प्रोटीन का बना (एंटीबॉडी) 3 (एंटीबॉडी दवा conjugates – एडीसी) -prodrugs प्रोटीन dimers 4,5 के संश्लेषण , स्वयं कोडांतरण प्रोटीन बहुलक संकर 6.7 nanomedicine 8 और प्रणालियों के रसायन शास्त्र 9 में इस्तेमाल करने के लिए के माध्यम से।
रसायन विज्ञान की विशिष्टता bioconjugation के लिए इस्तेमाल किया, जबकि हमेशा महत्वपूर्ण नहीं, सबसे कार्यात्मक प्रोटीन bioconjugates के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है ताकि के रूप में लक्ष्य प्रोटीन की सक्रिय साइट के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए। आदर्श bioconjugation प्रतिक्रिया सहित कई मानदंडों को पूरा करने की जरूरत है: ब्याज की प्रोटीन पर दुर्लभ या अद्वितीय साइटों मैं) को लक्षित है,ii) इस लक्ष्य की दिशा में चयनात्मक होना, iii) गैर denaturing शर्तों के तहत आगे बढ़ना खुलासा प्रोटीन से बचने के लिए और चतुर्थ) हो उच्च उपज के रूप में लक्ष्य प्रोटीन आम तौर पर उप-millimolar एकाग्रता में ही उपलब्ध है। Maleimide – सिस्टीन माइकल इसके अलावा इन सभी मानदंडों को पूरा करने के करीब आता है, और उस के कारण लंबे समय तक bioconjugate रसायन विज्ञान में 10 के क्षेत्र में एक विशेष दर्जा नहीं ली है। इसका कारण यह है i) कई प्रोटीन उनकी सतह पर केवल एक सिस्टीन अवशेषों से युक्त आनुवंशिक रूप से वहाँ इंजीनियर हो सकता है, द्वितीय) सही पीएच पर प्रतिक्रिया सिस्टीन के प्रति अत्यधिक चयनात्मक है, iii) यह जलीय बफ़र्स में सुचारू रूप से आगे बढ़ता है और iv) यह बहुत तेज है कुछ मामलों में 11 5000 एम -1 सेकंड -1 से अधिक होने की सूचना दी सिस्टीन युक्त प्रोटीन के लिए maleimides के दूसरे क्रम दर लगातार साथ। परंतु ब्याज की प्रोटीन कार्बनिक की एक छोटी सी (≈ 5-10%) राशि को सहन कर सकते सह विलायक 12, लगभग किसी भी maleimide-क्रियाशील डाई, पीओlymer, सतह से या किसी अन्य प्रोटीन प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, maleimides iodoacetamides, जो अधिक ऊंचा पीएच पर अन्य nucleophiles के साथ प्रतिक्रिया से ग्रस्त हैं की तुलना में प्रोटीन पर cysteines के लिए और अधिक विशिष्ट हैं; और डाइसल्फ़ाइड आधारित conjugations जो अम्लीय पीएच पर रखा जाना डाइसल्फ़ाइड विनिमय 13 को रोकने की जरूरत की तुलना में अधिक स्थिर है।
यहाँ हम एक प्रोटीन एक आरयू (द्वितीय) आधारित क्रोमोफोर और एक उदाहरण के रूप में redox प्रोटीन साइटोक्रोम ग के बीच प्रतिक्रिया का उपयोग कर एक एकल सिस्टीन अवशेषों से युक्त करने के लिए maleimide-क्रियाशील अणुओं के विकार के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इस प्रोटोकॉल अधिकांश अन्य एक सुलभ सतह सिस्टीन अवशेषों और इसी maleimide-क्रियाशील लक्ष्य युक्त प्रोटीन के लिए समान रूप से लागू होता है, यह एक और प्रोटीन, एक फ्लोरोसेंट डाई, एक क्रोमोफोर या एक सिंथेटिक बहुलक हो।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक bioconjugation से पहले शुरू सामग्री की शुद्धि अत्यंत महत्व का है। वाणिज्यिक पुनः संयोजक स्रोतों से प्राप्त प्रोटीन अक्सर ब्याज की प्रोटीन है, जो अलग सतह के रसायन शास्त्र और जेट हो सकता है की अन्य isoforms होते हैं?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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