タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em>経由で</em>システイン - マレイミドケミストリー
Summary
このプロトコルは、試薬の精製、反応条件、バイオコンジュゲートの精製およびバイオコンジュゲートの特徴付けを含む、マレイミドにタンパク質を含有するシステインのバイオコンジュゲーションのために必要な重要な手順を詳しく説明します。
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
バイオコンジュゲーションは、共有結合相互に、またはそのような染料、薬物またはポリマーなどの合成分子と1の生体分子を結合することを含みます。タンパク質バイオコンジュゲーション法の広範囲な蛍光色素標識1,2に至るまでのアプリケーションで多くの化学、生物学、ナノテクノロジーの研究グループで使用されている、タンパク質の作成 （抗体）3（抗体薬物複合体- ADCを）-prodrugsタンパク質二量体4,5の合成、ナノメディシン8およびシステム化学9で使用される自己集合タンパク質-ポリマーハイブリッド6,7に至ります。
標的タンパク質の活性部位を妨害しないように、バイオコンジュゲーションのために使用される化学反応の特異性は、必ずしも重要ではないが、ほとんどの機能性タンパク質のバイオコンジュゲートのために最も重要です。 、目的のタンパク質上のI）を標的と希少または固有のサイト：理想的な生物結合反応は、以下を含む、いくつかの基準を満たす必要がありますⅱ）ⅲ）タンパク質のアンフォールディングを回避するために、非変性条件下で進行、この目標に向かって選択的かつ標的タンパク質は通常、サブミリモル濃度でのみ使用できますようⅳ）高収量になります。マレイミド-システインマイケル付加は、これらすべての基準を満たすに近づくと、その理由のために長いバイオコンジュゲート化学10の分野で特別な地位を主張しています。私は、その表面上に一つのシステイン残基は、遺伝子が操作することができる含む）多くのタンパク質は、ii）の反応は、システインに向かって高度に選択的であり、正確なpHで、III）は、水性緩衝液中で円滑に進行し、iv）は、それが非常に高速であるためであります5,000 M -1秒を超える-1 11いくつかのケースで報告されたシステイン含有タンパク質に対するマレイミドの二次速度定数を有します。提供目的のタンパク質は、有機共溶媒12の小（≈五から十パーセント）の量、ほぼすべてのマレイミド官能染料、経口に耐えることができますlymerは、表面又は別のタンパク質は、タンパク質に結合させることができます。また、マレイミドは、上昇したpHで他の求核試薬と反応させることになりやすいですヨードアセトアミド、よりタンパク質上のシステインのために、より特異的です。およびジスルフィド交換13を防止するために、酸性pHで維持する必要がジスルフィドベースの活用よりも安定。
ここでは、（II）、Ruの間の反応を使用して、単一のシステイン残基を含有するタンパク質とマレイミド官能化分子の結合のための一般的なプロトコルを報告例として、発色団と酸化還元タンパク質シトクロムcをベース。このプロトコルは、アクセス可能な表面のシステイン残基と対応するマレイミド官能化標的を含むほとんどの他のタンパク質にも同様に適用可能であり、それは別のタンパク質、蛍光色素、発色団または合成ポリマーです。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオコンジュゲーションの前に出発物質の精製は、最も重要です。商業的な組換え供給源から得られたタンパク質は、しばしば、異なる表面化学と反応性を有することができ、目的のタンパク質の他のアイソフォームを含みます。例えば、記載生体結合に、市販のcyt cが両方イソ-1およびイソ-2のcyt Cの 12,14,17の混合物が含まれています。シトクロムcのISO-2および…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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