Syntese av Protein Bioconjugates<em> via</em> Cystein-maleimide kjemi
Summary
Denne protokollen detaljer de viktigste trinnene som kreves for bioconjugation av en cystein som inneholder protein til en maleimide, inkludert reagent rensing, reaksjonsbetingelser, biokonjugatet rensing og biokonjugatet karakterisering.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugation involverer kovalent å knytte en biomolekyl med hverandre eller med en syntetisk molekyl, så som et fargestoff, medikament eller en polymer. Protein bioconjugation metoder er nå mye brukt i mange kjemi, biologi og nanoteknologi forskningsgrupper med applikasjoner som spenner fra fluorescerende fargestoff merking 1,2, noe som gjør av protein (antistoff) -prodrugs 3 (antistoff medikamentkonjugater – ADCs) syntese av protein dimer 4,5 gjennom å selv-montering protein-polymer hybrider 6,7 som brukes i nanomedisin 8 og systemer kjemi 9.
Spesifisitet av kjemien benyttet for bioconjugation, samtidig som det ikke alltid er kritisk, er av største betydning for de funksjonelle protein bioconjugates, slik at det ikke forstyrrer det aktive sete av målproteinet. Den ideelle bioconjugation reaksjon må oppfylle flere kriterier, blant annet: i) rettet mot sjeldne eller unike steder på protein av interesse,ii) være selektiv mot dette målet, iii) går under ikke-denaturerende betingelser for å unngå protein utfoldelse og iv) være høy avkastning som mål protein er vanligvis bare tilgjengelig på sub-millimolar konsentrasjon. Den maleimid – cystein Michael-addisjon kommer nær til å oppfylle alle disse kriteriene, og har av den grunn lenge ifølge en spesiell status på området biokonjugatet kjemi 10. Dette er fordi i) mange proteiner som inneholder bare en cysteinresidie på sin overflate kan fremstilles ved gensløyd der, ii) ved den riktige pH-verdi i reaksjons er meget selektive overfor cystein, iii) den fortsetter jevnt i vandige buffere, og iv) det er meget rask med den annen ordens hastighetskonstant av maleimider til cystein-inneholdende proteiner som er rapportert å overstige 5000 M -1 sek -1 i noen tilfeller 11. Forutsatt at proteinet av interesse kan tolerere en liten (≈ 5-10%) mengde av organisk ko-oppløsningsmiddel 12, kan nesten alle maleimid-funksjonalisert fargestoff, po-polymer, overflate eller et annet protein kan knyttes til proteiner. I tillegg er maleimider er mer spesifikk for cysteinene på proteiner enn iodoacetamides, som er mer tilbøyelig til å reagere med andre nukleofiler ved forhøyet pH-verdi; og mer stabil enn disulfid-baserte bøyning som må holdes ved sur pH for å hindre disulfid utveksling 13.
Her kan vi rapportere en generisk protokoll for konjugering av maleimid-funksjonalisert molekyler til et protein som inneholder en enkelt cysteinresidie ved hjelp av reaksjonen mellom en Ru (II) -basert kromofor og redoks-proteinet cytokrom c som et eksempel. Denne protokollen er like anvendelig for de fleste andre proteiner inneholdende et tilgjengelig overflate cysteinresidie og det tilsvarende maleimid-funksjonalisert mål, det være seg et annet protein, et fluorescerende fargestoff, en kromofor eller en syntetisk polymer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rensing av utgangsmaterialene før en bioconjugation er av største betydning. Proteiner erholdt fra kommersielle kilder rekombinante inneholder ofte andre isoformer av proteinet av interesse, som kan ha forskjellig overflatekjemi og reaktivitet. For eksempel, i den beskrevne bioconjugation, inneholder det kommersielt tilgjengelige cyt c en blanding av begge deler iso-1 og iso-2 cyt c 12,14,17. Iso-2 og iso-1-former av cytokrom c er i stor grad homolog med den største forskjellen e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
