Síntese de Bioconjugados de proteínas<em> via</em> Química cisteína-maleimida
Summary
Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugação envolve a ligação covalente de biomoléculas com um outro ou com uma molécula sintética, tal como um corante, ou um polímero de drogas. Métodos bioconjugação proteína são agora amplamente utilizados em muitos grupos de pesquisa química, biologia e nanotecnologia, com aplicações que vão desde a rotulagem corante fluorescente 1,2, fazendo de proteínas (anticorpos) -prodrugs 3 (conjugados de medicamentos com anticorpos – ADCs) síntese de dímeros da proteína de 4,5 , por meio de híbridos de proteína-polímero de auto-montagem 6,7 utilizados em nanomedicina 8 e sistemas química 9.
Especificidade da química utilizada para bioconjugação, embora nem sempre seja crítica, é de extrema importância para bioconjugados proteína mais funcionais, de modo a não interferir com o local activo da proteína alvo. A reação bioconjugação ideal precisa cumprir vários critérios, incluindo: i) segmentação locais raras ou únicas sobre a proteína de interesse,ii) ser selectivo em relação a este alvo, iii) prosseguir sob condições não desnaturantes para evitar a proteína se desdobrar e iv) ser de alto rendimento como a proteína alvo está geralmente disponível apenas em concentração sub-milimolar. A maleimida – cisteína Michael disso vem perto de cumprir todos estes critérios, e tem por essa razão muito reivindicada um estatuto especial no campo da química bioconjugado 10. Isto é porque i) muitas proteínas que contenham resíduos apenas uma cisteína na sua superfície podem ser geneticamente manipulados há, ii) ao valor de pH correcto a reacção é altamente selectiva para com a cisteína, iii) prossegue suavemente em tampões aquosos e IV) é muito rápido com a segunda constante de velocidade a fim de maleimidas a proteínas contendo cisteína relatados para exceder 5000 M-1 s-1, em alguns casos 11. Desde que a proteína de interesse pode tolerar uma quantidade pequena (≈ 5-10%) de co-solvente orgânico 12, quase todo o corante funcionalizado com maleimida, poLymer, ou outra proteína de superfície pode ser ligada a proteínas. Além disso, as maleimidas são específicas para mais cisteínas em proteínas do que iodoacetamidas, que são mais propensos a reagir com outros nucleófilos a pH elevado; e mais estável do que conjugações à base de dissulfureto, que devem ser mantidos a pH ácido para impedir a permuta de dissulfureto 13.
Aqui relatamos um protocolo genérico para a conjugação de moléculas funcionalizado com maleimida para uma proteína que contém um único resíduo de cisteína utilizando a reacção entre um de Ru (II), com base na cromóforo e a proteína redox citocromo C como um exemplo. Este protocolo é igualmente aplicável para a maioria das outras proteínas contendo um resíduo de cisteína superfície acessível e o alvo funcionalizado com maleimida correspondente, seja uma outra proteína, um corante fluorescente, um cromóforo ou um polímero sintético.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purificação das matérias-primas antes de uma bioconjugação é de extrema importância. As proteínas obtidas a partir de fontes recombinantes comerciais muitas vezes contêm outros isoformas da proteína de interesse, que pode ter a química de superfície e reactividade diferente. Por exemplo, no bioconjugação descrito, o cit disponível comercialmente c contém uma mistura de ambos iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e as formas de citocromo c 1 iso-são em grande parte hom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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